Isolering, anrikning och underhåll av celler medulloblastom Stem
Summary
Detta protokoll beskriver isolering, anrikning och underhåll av stamceller medulloblastom tumörceller från muterade möss med ektopisk Sonic Hedgehog pathway aktivitet.
Abstract
Hjärntumörer har föreslagits att äga en liten population av stamceller som är den grundläggande orsaken till Tumörgenesens. Neurosphere analyser har allmänt antagits att studera vilken typ av neurala stamceller, även sådana som härrör från normal och tumörform vävnader. Men betydande mängder av differentiering och celldöd är vanliga i odlade neurospheres sannolikt på grund av suboptimala tillstånd som tillgänglighet för alla celler inom sfären aggregat till kultur medium.
Medulloblastom, den vanligaste barn CNS-tumör, kännetecknas av snabb utveckling och tendens att sprida sig längs hela hjärnan spinal axeln med dystra kliniskt utfall. Medulloblastom är en neuroepiteliala tumör i lillhjärnan, som står för 20% och 40% av intrakraniell och bakre fossa tumör i barndomen, respektive 1. Det är nu väletablerat att Shh signalering stimulerar spridningen av cerebellär prekursorer granulat neuron (CGNPs) under cerebellär utveckling 2-4. Ett flertal studier med hjälp av musmodeller, där Shh vägen är konstitutivt aktiverad, har kopplat Shh signalering med medulloblastom 5-9.
En färsk rapport visar att en delmängd av medulloblastom celler från Patched1 LacZ / + möss är cancer stamceller, som kan initiera och uppförökningsmaterial tumörer 10. Här beskriver vi en effektiv metod att isolera, berika och underhålla tumör stamceller från olika musmodeller av medulloblastom, med konstitutivt aktiverad Shh väg på grund av en mutation i Smoothened (11, härefter kallat SmoM2), en GPCR som är avgörande för Shh väg aktivering. I varje isolerat medulloblastom vävnad, kunde vi etablera ett flertal mycket proliferativ kolonier. Dessa celler kraftfullt uttryckte flera neurala markörer stamceller som nestin och Sox2 kan genomgå seriella passager (större än 20) och var klonogena. Även om dessa odlade tumör stamceller var relativt små, ofta bipoar med hög nukleär cytoplasmisk förhållande vid odling under förhållanden som gynnar tillväxt stamceller, ändras de dramatiskt sin morfologi, utökad flera cellulära processer, tillplattad och drog sig ur cellcykeln vid övergång till en cell odlingsmedium kompletteras med 10% fetalt bovint serum. Ännu viktigare är att dessa tumörer stamceller differentieras till Tuj1 + eller Neun + nervceller, GFAP + astrocyter och CNPase + oligodendrocyter, vilket understryker deras multi-potens. Dessutom var dessa celler kan sprida sekundära medulloblastomas när orthotopically transplanteras i värd möss.
Protocol
Discussion
Vi beskriver ett effektivt sätt att isolera, berika och underhålla celler medulloblastom härrör från primära tumören hämtas från muterade möss med konstitutivt aktiv Hedgehog-signalering. Vi fann att ett kritiskt steg i ett framgångsrikt införande av ett hälsosamt tumör stamcellslinje är Accutase behandling som används vid dissociation av den primära tumören vävnad. Vår erfarenhet är att när de först ta avstånd tumörvävnad från lillhjärnan, 4 minuter på 50% Accutase behandling vid 37 ° C, f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie har finansierats med bidrag från Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485) Childhood hjärntumör Foundation och National Institutes of Health (NS042205).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | ||
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X | |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X | |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% | |
| Gelatin | Sigma | G1393 | 0.1% | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM | |
| Primaria dishes | Fisher | 087724C | ||
| Sox2 antibody | Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 | |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 | |
| YFP antibody | Molecular Probes | A11122 | Rabbit, 1:2000 | |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 | |
| Tuj1 antibody | Sigma | T5076 | Mouse, 1:2000 | |
| NeuN antibody | Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 | |
| CNPase antibody | Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
References
- Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy. Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).
- Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).
- Fan, X., Eberhart, C. G. Medullablastoma Stem Cells. J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).
- Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer. 124 (1), 109-109 (2009).
- O’Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review. Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).
- Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice. Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).
- Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. The Origins of Medulloblastoma Subtypes. Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).
- Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma. Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).
- Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway. Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).
- Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).
