Isolamento Axoplasm da Nerve Rat sciatico
Summary
Dimostriamo un protocollo per l'isolamento axoplasm da nervo sciatico ratto adulto sulla base di dissezione di fasci nervosi e l'incubazione in media ipotonica per liberare mielina e lisare non assonale strutture, seguita da estrazione del restante assone arricchito di materiale.
Abstract
Isolamento di puro citoplasma assonale (axoplasm) dal nervo periferico è di fondamentale importanza per gli studi biochimici di molti processi biologici. In questo articolo, dimostrare e descrivere un protocollo per l'isolamento axoplasm dal nervo sciatico ratto adulto basato sui seguenti passi: (1) dissezione dei fasci nervosi e la separazione del tessuto connettivo, (2) incubazione di brevi segmenti di fasci nervosi nel medio ipotonica a rilasciare mielina e lisare non assonale strutture; e (3) estrazione dei rimanenti assone arricchito materiale. Proteomica e caratterizzazione biochimica di questa preparazione ha confermato un alto grado di arricchimento per i componenti assonale.
Protocol
Discussion
Analisi biochimiche e proteomiche hanno confermato che questa procedura riduce la contaminazione delle cellule gliali siero e 3 rispetto ai metodi precedentemente descritti per l'isolamento axoplasm dalla stretta meccanica 1. Abbiamo usato questo protocollo axoplasm isolamento di esplorare dineina basato segnalazione retrograda dopo la lesione del nervo sciatico 2, e si aspettano di avere utilità nell'esplorazione di molti altri processi in adulti nervi periferici, tra cui asson…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
- Male Wistar rats (8-10 weeks old)
- PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml
- Eppendorfs for 1.5 ml
- Sterilized plastic dishes 35 mm
- Dissecting tools including: scissors and fine forceps
- Binocular and table light
Antibodies
Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).
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