Влияние жесткости субстратов на клеточные функции могут быть смоделированы<em> В пробирке</em> Использованием полиакриламидных гидрогелей различной податливости.
Abstract
Ткань жесткость является важным фактором клеточной функции, а также изменения в ткани жесткость, как правило, связано с фиброзом, рак и сердечно-сосудистые заболевания 1-11. Традиционные ячейки биологических подходов к изучению клеточной функции включают культивирования клеток на жесткой субстрата (пластиковой посуды или стекла покровные), который не может объяснить влияние упругой ECM или ECM изменения жесткости между тканями. Для моделирования в естественных условиях ткани соблюдением условий в пробирке, и мы, и другие используют ECM-покрытием гидрогелей. В нашей лаборатории, гидрогели на основе полиакриламида, который может имитировать спектр тканей податливости видел биологически 12. "Реактивный" скользит крышка генерируются путем инкубации с NaOH с последующим добавлением 3-APTMS. Глутаральдегид используется для сшивки 3-APTMS и полиакриламидном геле. Решение акриламида (AC), бис-акриламида (Bis-AC) и персульфата аммония используется для полимеризации гидрогеля. N-гидроксисукцинимида (NHS) включается в решение переменного тока для сшивания ECM белка гидрогеля. После полимеризации гидрогеля, геля поверхность покрыта белков ECM выбора, такие как фибронектин, витронектин, коллаген и др.
Жесткость гидрогеля можно определить по реологии или атомно-силовой микроскопии (АСМ) и корректируется при изменении доли переменного тока и / или бис-AC в решение 12. Таким образом, субстрат жесткости можно подобрать жесткость биологических тканей, которые также могут быть количественно, используя реологию или АСМ. Клетки могут быть посеяны на этих гидрогелей и культурной основе экспериментальных условиях требуется. Визуализация клеток и их восстановление для молекулярного анализа проста. В этой статье мы определяем мягких субстратах, как те, которые имеют модули упругости (Е) <3000 Паскаль и жесткие субстраты / тканей, как и с Е> 20 000 Паскаль.
Protocol
Подготовка Покровные необходимо обрабатывать в автоклаве. Стерильной дистиллированной или деионизированной воды должна быть использована для приготовления растворов и для стирки покровные. AC (40% вес / объем) и бис-AC (1% м / о) растворы стерилизуют путем фильтрации 0,2 мкм. …
Discussion
Одним из важнейших элементов процесса полимеризации гидрогеля, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, которая позволит клеткам связываться с покровным стеклом, а не ECM-покрытием гидрогеля себя. Это можно предотвратить, тщательно пипетирования полимеризации в растворе после в?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работы нашей лаборатории проводится при поддержке грантов от Национального института здоровья.
Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels. J. Vis. Exp. (42), e2089, doi:10.3791/2089 (2010).