Test för att mäta aktiviteten hos Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase
Summary
Aktiviteten i den inducerbara lysin decarboxylase övervakas genom att reagera substratet L-lysin och produkten cadaverine med 2,4,6-trinitrobenzensulfonic syra och bildar addukter som har differentiell löslighet i toluen.
Abstract
Escherichia coli är en enterisk bakterie som kan växa över ett brett spektrum av pH-värden (pH 5 – 9) 1 och, otroligt, kan överleva extrema sura betonar inklusive passagen genom däggdjur magen där pH-värdet kan sjunka så lågt som pH 1 till 02 februari. För att möjliggöra ett så brett spektrum av surt pH-värde överlevnad, E. coli äger fyra olika inducerbara aminosyra decarboxylases att decarboxylate deras substrat aminosyror i en proton-beroende sätt och därmed höjer den interna pH. Den decarboxylases inkluderar glutaminsyra decarboxylases gada och GadB 3, arginin decarboxylase Adia 4, lysin decarboxylase LdcI 5, 6 och ornitindekarboxylas SPEF 7. Alla dessa enzymer använder Pyridoxal-5'-fosfatsyntasgen som en co-faktor 8 och fungerar tillsammans med inre membran substrat-produkt antiporters som tar bort dekarboxylering produkter till externt medium i utbyte mot nya substrat 2. I fallet LdcI är lysin-cadaverine antiporter kallas CadB. Nyligen har vi bestämt att X-ray kristall struktur LdcI till 2,0 A, och vi upptäckte en ny liten molekyl bunden till LdcI de stränga svar regulatorn guanosin 5'-difosfat, 3'-difosfat (ppGpp) 14. De stränga respons uppstår när exponentiellt växande celler erfarenhet näringsämne berövande eller någon av ett antal andra påfrestningar 9. Som ett resultat av celler producerar ppGpp vilket leder till en signalering kaskad kulminerar i övergången från exponentiell tillväxt till stationär fas tillväxt 10. Vi har visat att ppGpp är en specifik hämmare av LdcI 14. Här beskriver vi de lysin decarboxylase analysen ändras från analysen utvecklats av Phan et al. 11, som vi har använt för att bestämma aktiviteten hos LdcI och effekten av pppGpp / ppGpp på denna verksamhet. Den LdcI dekarboxylering reaktionen bort α-karboxi grupp av L-lysin och producerar koldioxid och polyamin cadaverine (1,5-diaminopentane) 5. L-lysin och cadaverine kan reagerade med 2,4,6-trinitrobenzensulfonic syra (TNBS) vid höga pH-värde för att generera N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) och N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysin), respektive 11. Den TNP-cadaverine kan separeras från TNP-lysin som det förra är lösliga i organiska lösningsmedel som toluen medan den senare är inte (se figur 1). Den linjära utbud av analysen har fastställts empiriskt med renade cadaverine.
Protocol
Discussion
I lysin decarboxylase analysen är TNBS reagerade med det primära aminer av L-lysin och cadaverine att bilda TNP-lysin och TNP-cadaverine addukter (Figur 1). På grund av närvaron av karboxylsyra grupp på TNP-lysin förblir denna addukt lösliga i vatten medan TNP-cadaverine, saknar karboxylsyra grupp, kan uppdelning i toluen 11. Denna typ av analys kan utnyttjas mer allmänt om andra typer av aminosyror där förlusten av en karboxylsyra grupp sker under reaktionen. Detta sker under dekarboxylering av L-O…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) för att skicka oss bakteriestammar, plasmider och nödvändiga protokoll. Vi tackar Dr John Glover (Institutionen för biokemi, University of Toronto) för användning av SpecraMax plattläsaren. Storbritannien är mottagare av ett nationellt Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Utbildningsbidrag, en kanadensisk Institutes of Health Research Strategisk utbildningsprogram på Strukturbiologi av membranproteiner är kopplat till sjukdom, och en University of Toronto öppen gemenskap. Detta arbete stöddes av ett bidrag från den kanadensiska Institutes of Health Research (MOP-67.210) till WAH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. 생화학. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D., Curtiss, R., Neidhardt, F. C. . Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l., Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
