Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir
Summary
Indüklenebilir lizin dekarboksilaz aktivitesi toluen diferansiyel çözünürlüğü adducts oluşturmak için substrat L-lizin ve ürün cadaverine 2,4,6-trinitrobenzensulfonic asit ile reaksiyona girerek izlenir.
Abstract
1 ve inanılmaz derecede düşük pH düşebilir memeli mide geçişi de dahil olmak üzere aşırı asit vurguluyor hayatta kalmak için – Escherichia coli, pH değerleri (9 pH 5) geniş bir yelpazede üzerinde büyüyen yetenekli bir enterik bakteridir pH 1 – 2 2. Asidik pH hayatta kalma, E. gibi geniş bir yelpazede etkinleştirmek için coli, bir proton-bağımlı bir şekilde decarboxylate kendi substrat amino asitler dolayısıyla iç pH yükselterek dört farklı indüklenebilir amino asit dekarboksilaz sahiptir . Dekarboksilaz glutamik asit dekarboksilaz GADA ve GadB 3, arginin dekarboksilaz adia 4, lisin dekarboksilaz LdcI 5, 6 ve ornitin dekarboksilaz SpeF 7 içerir. Tüm bu enzimlerin piridoksal-5'-fosfat, co-faktör 8 olarak kullanmaktadır ve dış ortama taze substrat karşılığında 2 dekarboksilasyon ürünleri kaldırın iç membran substrat ürün antiporters birlikte işlev görür. LdcI durumunda, lizin-cadaverine antiporter CadB denir. Son zamanlarda, 2.0 Å LdcI X-ray kristal yapısı belirlenir ve LdcI sıkı yanıt regülatör guanozin 5'-difosfat, 3'-difosfat (ppGpp) 14 bağlı bir roman küçük molekül keşfetti. Katlanarak büyüyen hücrelerin besin yoksunluğu ya da diğer stresler 9 bir dizi deneyim sıkı bir tepki oluşur. Sonuç olarak, hücreler, üstel büyüme, sabit faz büyüme 10 vardiya sonuçlanan bir sinyal kaskad yol açar ppGpp üretirler . Biz ppGpp LdcI 14 spesifik bir inhibitörü olduğunu göstermiştir. Burada Phan ve arkadaşları tarafından geliştirilen testin modifiye lisin dekarboksilaz deneyi açıklar. 11, LdcI faaliyeti ve bu faaliyetin pppGpp / ppGpp etkisini belirlemek için kullanmış olduğunuz. LdcI dekarboksilasyon tepki L-lizin α-karboksi grubu kaldırır ve karbon dioksit ve poliamin cadaverine (1,5-diaminopentane) 5 üretir. L-lizin ve cadaverine sırasıyla, N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (EGM-cadaverine) ve N, N'-bistrinitrophenyllysine (EGM-lisin) oluşturmak için yüksek pH 2,4,6-trinitrobenzensulfonic asit (TNBS) ile reaksiyona girer. 11. EGM-cadaverine, ikincisi ise (Bakınız Şekil 1) eski, toluen gibi organik çözücülerde çözünür olarak EGM-lizin ayrılabilir. Testin doğrusal aralığı, ampirik olarak saflaştırılmış cadaverine kullanarak tespit edildi.
Protocol
Discussion
Lisin dekarboksilaz tayininde, TNBS EGM-lizin ve EGM-cadaverine adducts (Şekil 1) oluşturmak için L-lizin ve cadaverine birincil aminler ile reaksiyona girer. Karboksilik asit grubu eksik EGM-cadaverine, toluen 11 bölünme yeteneğine sahip iken, EGM-lizin karboksilik asit grubun varlığı nedeniyle, bu adduct suda çözünür kalır. Bu tip testin bir karboksilik asit grubu kaybı reaksiyon sırasında ortaya çıkan amino asitler diğer türleri hakkında daha geniş kullanılabilir. Bu indüklenebilir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bize bakteri suşlarının plazmid ve gerekli protokolleri göndermek için Dr. Michael Cashel (Sağlık, Bethesda, MA, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri) teşekkür ederim. Biz SpecraMax plaka okuyucu kullanımı için Dr. John Glover (Biyokimya Anabilim Dalı, Toronto Üniversitesi) teşekkür ederim. İngiltere, Kanada Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Lisansüstü Bursu, Hastalıklara Bağlı Membran Proteinlerin Yapısal Biyoloji, Kanada Sağlık Araştırma Stratejik Eğitim Programı Enstitüleri ve Toronto Açık Bursu Üniversitesi alıcı. Bu çalışma WAH Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (MOP-67.210) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. 생화학. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D., Curtiss, R., Neidhardt, F. C. . Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l., Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
