Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase
Summary
A atividade da descarboxilase induzível lisina é monitorado pela reação do substrato L-lisina e cadaverina o produto com 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-ácido para formar adutos que têm solubilidade diferencial em tolueno.
Abstract
A Escherichia coli é uma bactéria entérica que é capaz de crescer em uma ampla faixa de valores de pH (pH 5-9) 1 e, incrivelmente, é capaz de sobreviver ácido extremo frisa, incluindo a passagem pelo estômago de mamíferos, onde o pH pode cair para valores tão baixos como pH 1 – 2 2. Para habilitar a um leque tão amplo de sobrevivência pH ácido, E. coli possui quatro diferentes induzível decarboxylases aminoácido que decarboxylate ácidos seu substrato aminoácidos de uma maneira próton-dependentes elevando o pH interno. O decarboxylases incluem o ácido glutâmico decarboxylases Gada e GadB 3, a arginina descarboxilase Adia 4, a lisina descarboxilase LdcI 5, 6 e ornitina decarboxilase SpeF 7. Todas essas enzimas utilizam piridoxal-5'-fosfato como um co-fator 8 e funcionam em conjunto com a membrana interna-substrato-produto antiporters que remover produtos descarboxilação ao meio externo, em troca de substrato fresco 2. No caso de LdcI, o antiporter lisina cadaverina é chamado CADB. Recentemente, nós determinamos a estrutura de cristal de raios-X de LdcI a 2,0 Å, e nós descobrimos um romance de pequenas moléculas obrigado a LdcI o regulador de guanosina 5'-difosfato rigorosos resposta, difosfato-3'(ppGpp) 14. A resposta severas ocorre quando as células em crescimento exponencial experiência de privação de nutrientes ou uma de uma série de outros estresses 9. Como resultado, as células produzem ppGpp que leva a uma cascata de sinalização que culminou com a mudança de crescimento exponencial para o crescimento da fase estacionária 10. Nós demonstramos que ppGpp é um inibidor específico da LdcI 14. Aqui nós descrevemos o ensaio descarboxilase lisina, modificado a partir do ensaio desenvolvido por Phan et al. 11, que temos usado para determinar a atividade de LdcI eo efeito de pppGpp / ppGpp essa actividade. A reação de descarboxilação LdcI remove o grupo α-carboxila de L-lisina e produz dióxido de carbono ea cadaverina poliamina (1,5-diaminopentane) 5. L-lisina e cadaverina pode ser reagido com ácido 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) em pH elevado para gerar N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) e N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina), respectivamente 11. O TNP-cadaverina podem ser separados do TNP-lisina como o primeiro é solúvel em solventes orgânicos como o tolueno, enquanto o último não é (ver Figura 1). A faixa linear do ensaio foi determinada empiricamente usando purificada cadaverina.
Protocol
Discussion
No ensaio descarboxilase lisina, TNBS é reagido com as aminas primárias de L-lisina e cadaverina para formar TNP-lisina e cadaverina TNP-adutos (Figura 1). Devido à presença do grupo de ácido carboxílico em TNP-lisina, este permanece aduto solúvel em água, enquanto o TNP-cadaverina, faltando o grupo ácido carboxílico, é capaz de particionamento em tolueno 11. Este tipo de ensaio pode ser utilizado de forma mais ampla em outros tipos de aminoácidos, onde a perda de um grupo de ácido carboxílico o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Dr. Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA) por enviar cepas de bactérias, plasmídeos, e protocolos necessários. Agradecemos ao Dr. John Glover (Department of Biochemistry, University of Toronto) para uso do leitor de placas SpecraMax. Reino Unido é o destinatário de uma National Ciências e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC) Bolsa de Pós-Graduação, a Canadian Institutes of Health Programa de Formação de Investigação Estratégica na Biologia Estrutural de Proteínas de Membrana ligados à doença, e da Universidade de Toronto Fellowship Open. Este trabalho foi financiado por uma doação do Canadian Institutes of Health Research (MOP-67210) para WAH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
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