In vivo Micro-cirkulation Mätning i skelettmuskel genom Intra-vitala Mikroskopi

Summary

En ny mångsidig metod för observation av mikrocirkulation presenteras. Det anses lämpliga för observation under lång tid, och för kombination med pharmacophysiological eller molekylärbiologiska interventioner.

Abstract

BAKGRUND: Regulatoriska faktorer och detaljerade fysiologi av in vivo mikrocirkulationen har varit inte helt klarlagts efter många olika former av avbildning hade uppfunnit. Medan många makroskopiska parametrar blodflödet avspeglar flödeshastighet, förändringar i blodets strömningshastighet och röda blodkroppar (RBC) flux håller inte linjärt samband i mikroskopiska observationer. Det finns rapporter om diskrepans mellan RBC hastighet och RBC flux, RBC flux och plasma flöde volym, och tid och rum heterogena flödesreglering i perifera vävnader i mikroskopiska observationer, en vetenskaplig grund för kravet på mer detaljerade studier i mikrocirkulationen reglering med hjälp av intravital mikroskopi.

METODER: Vi ändrade Jeff Lichtman metod av in vivo mikroskopisk observation av muskler mus sternocleidomastoideus. Möss är sövda, ventilerade och injiceras med PKH26L-fluorescerande röda blodkropparna för mikroskopisk observation.

RESULTAT & SLUTSATSER: fluorescerande röda blodkroppar upptäcks och kännetecknas även av ett brett fält mikroskop. Muskelsammandragning framkallas genom elektrisk stimulering ökar RBC flux. Kvantifiering av andra parametrar, bland annat RBC hastighet och kapillär densitet var möjligt. Möss tolereras väl operationen, injektion av färgade röda blodkropparna, mikroskopisk observation, och elektrisk stimulering. Inga muskler eller blodkärl skada observerades, vilket tyder på att vår metod är relativt sett mindre invasiv och lämpar sig för långsiktiga observationer.

Protocol

RBC membranfärgning Mus röda blodkroppar korrigerades från samma musstam med heparin. Mus RBC färgades med PKH26 färgämne (551/567 nm, Röd fluorescerande celler länkare kit, Sigma, USA). RBC spolades i PBS och inkuberas med 2μM lösning av PKH26 färg i 5 minuter i rumstemperatur. Reaktionen stoppades genom att lägga till plasma (värmeinaktiverad i 1 timme vid 65 ° C i förväg) och inkuberas under 1 minut. Den färgade RBC spolades 5 gånger med PBS. <p clas…

Discussion

Viktiga techinical punkter är följande: (1) underhåll av fysiologisk status för djur (ventilation, pH-värde perfusative lösningen, kroppstemperatur), (2) injektionsvolym av de färgade RBC, och (3) förutsättningar för observation (optimal lins urval, fluorescensintensiteten). Potentiella framtida tillämpningar är följande: (a) kombination med pharmacophysiological och / eller molekylärbiologiska insatser, (b) långvarig observation av arteriell / arteriolo-skleros och kärlnybildning.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PKH26 dye		Sigma		551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice	Animal			Three to six month old males
pentobarbital				anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.