Este protocolo consiste en un no-radiactivos<em> In-situ</emProcedimiento> hibridación que permite la identificación simultánea de dos especies de transcripción, en una resolución única célula, en secciones finas de cerebro de los vertebrados.
Aquí se describe una versión modificada de un fluorescente doble<em> In situ</emHibridación> (dFISH) método optimizado para la detección de dos mRNAs de interés en nuevas secciones del cerebro congelado. Nuestro grupo ha utilizado con éxito este enfoque para el estudio de genes co-regulación. Más específicamente, hemos utilizado este método para explorar dFISH la organización anatómica, propiedades neuroquímicas, y el impacto de la experiencia sensorial en el centro de los circuitos sensoriales, con una resolución única célula. Este protocolo ha sido validado en el tejido cerebral de ratones, ratas y pájaros, pero se espera que sea fácilmente adaptable a otras especies de vertebrados, así como a una amplia gama de tejidos no neuronales. En esta película una demostración detallada de las principales etapas de este procedimiento.
Hemos utilizado este protocolo para estudiar cómo el cerebro de los vertebrados es neuroquímico y funcionalmente organizada, y para determinar la conducta relevante impacto estímulos sensoriales de la maquinaria del genoma de las neuronas en el cerebro adulto 80-10. Hemos utilizado con éxito este método en el tejido cerebral de ratones, ratas y pájaros, pero anticipamos que este protocolo se adapta fácilmente a las secciones del cerebro obtenidas de una gran variedad de especies de vertebrados y, quiz?…
The authors have nothing to disclose.
El trabajo apoyado por subvenciones del NIH / NIDCD y la Fundación de Schmitt a la PR.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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DEPC | VWR | IC15090225 | toxic substance | |
PCR purification kit | QIAgen | 28104 | ||
Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | toxic substance | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | ||
T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | ||
Tris-HCl (1 M, pH 7.5) | VWR | IC816124 | ||
MgCl2 (1 M) | Sigma | 449172 | ||
Spermidine (1 M) | Sigma | S0266 | ||
DIG RNA labeling mix | Roche | NC9380805 | ||
Biotin RNA labeling mix | Roche | NC9440104 | ||
RNasin | Promega | N2111 | ||
BSA | Sigma | 05491 | ||
DTT | Sigma | D5545 | ||
Sephadex G50 | VWR | 95016-772 | ||
EDTA | VWR | 101384-758 | ||
SDS | Sigma | L4390 | ||
Transfer (t)RNA | Invitrogen | 15401011 | ||
10X MOPS | VWR | 14221-398 | toxic substance | |
Paraformaldehyde | VWR | AAAL04737-36 | toxic substance | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | ||
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | ||
NaOH | VWR | SX0600-1 | ||
Triethanolamine | VWR | IC15216391 | ||
Acetic anhydride | VWR | MK242002 | toxic substance | |
SSPE | VWR | 82021-488 | ||
Formamide | VWR | JT4028-1 | toxic substance | |
Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | ||
Mineral oil | VWR | IC15169491 | ||
Chloroform | VWR | BDH1109 | organic solvent | |
Deionized formamide | Sigma | F9037 | toxic substance | |
Hydrogen peroxide | VWR | VW36901 | toxic substance | |
Tween 20 | Sigma | P1379 | ||
Triton X-100 | J. T. Baker | X198-05 | ||
Anti-DIG HRP | Roche | 11093274910 | ||
Anti-biotin peroxidase | Vector | SP3010 | ||
TSA Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20935 | ||
TSA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20932 | ||
Hoechst | VWR | 200025-538 | ||
Vectashield | Vector | H-1000 | ||
embedding mold | VWR | 15160-157 | ||
cryostat | Leica | CM 1850 | ||
Superfrost plus slide | VWR | 89033-052 |
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