Metoder för att förbereda ett injicerbart matris gel från decellularized vävnad och injiceras i råtta hjärtmuskeln<em> In vivo</em> Beskrivs.
Detta protokoll innehåller metoder för beredning av ett injicerbart extracellulärt matrix (ECM) gel för hjärtinfarkt applikationer tissue engineering. Kortfattat är decellularized vävnad frystorkad, malts, enzymatiskt smälta, och sedan tagit till fysiologiska pH. Den frystorkning tar bort allt vatten innehåll från vävnaden, vilket resulterar i torra ECM som kan malas till ett fint pulver med en liten kvarn. Efter fräsning är ECM pulvret kokas med pepsin för att bilda en injicerbara matris. Efter justering till pH 7,4, kan det flytande matrisen materialet sprutas in i hjärtmuskeln. Resultat av tidigare karakterisering analyser har visat att matrisen geler produceras från decellularized perikardiell och hjärtinfarkt vävnad behålla infödda ECM-komponenter, inklusive olika proteiner, peptider och glykosaminoglykaner. Eftersom användningen av detta material för tissue engineering, in vivo karakterisering är särskilt användbart, här, (LV) en metod för att utföra en intramural injektion i vänster kammare fri vägg presenteras som ett sätt att analysera värd reaktion på matrisen gelen i ett litet djur modell. Tillgång till brösthålan erhålls genom membranet och injektionen görs något över apex i LV fria väggen. Den biologiskt härledda schavotten kan visualiseras genom biotin-märkning före injektion och sedan färgning vävnadssnitt med pepparrot peroxidaskonjugerade neutravidin och visualisera via Diaminobenzidin (DAB) färgning. Analys av injektionen regionen kan också göras med histologiska och immunhistokemisk färgning. På detta sätt var de tidigare undersökt perikardiell och hjärtinfarkt matris geler visat att bilda fibrer, porösa nätverk och främja kärlnybildning inom injektionen regionen.
Denna metod gör det möjligt för produktion av biologiskt framställda, injicerbara ställningar för hjärtinfarkt tissue engineering. Även om dessa metoder ursprungligen utvecklade för tillverkning och in vivo test av en hjärtinfarkt matris gel och presenteras här med en perikardiell matris gel, kan detta protokoll anpassas för användning med någon vävnad, förutsatt att vävnaden kan lämpligen decellularized. Decellularization ska utföras och verifieras innan användningen av dessa metoder, före…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds delvis av NIH direktörens Nya Innovator Award Program, en del av NIH färdplanen för medicinsk forskning genom bidrag nummer 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. vill tacka NSF för en Graduate Research Fellowship.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Reagents: | ||||
Pepsin | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Lyophilized | |
Biotin | Thermo Scientific | 21217 | ||
Neutravidin-HRP | Thomas Scientific | 21130 | ||
Equipment: | ||||
Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | ||
Labconco Lyophilizer | Labconco, Inc | 7670520 | ||
Surgical supplies: | ||||
Betadine | Purdue Products, L.P. | 67618-154-16 | ||
Lactated Ringers Solution | MWI | 003966 | ||
KY Jelly | MWI | 28658 | ||
Lidocaine, 2% | MWI | 17767 | ||
Buprenorphine hydrochloride | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd. | 12496-0757-1 | ||
Artificial tear ointment | Fisher | NC9860843 | ||
Triple antibiotic ointment | Fisher | 19082795 | ||
Isoflurane | MWI | 60307-120-25 | ||
Otoscope | MWI | 008699 | ||
Stop cock | MWI | 006245 | ||
3-0 Vicrile suture | MWI | J327H | ||
5-0 Proline suture | MWI | s-1173 | ||
Reverse cutting (RC) needle | Ethicon | 8684G | ||
Microhemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | ||
Rat tooth microforceps | Fine Science Tools | 11084-07 | ||
No. 10 scalpel | Fine Science Tools | 10110-01 | ||
Blunt scissors | Fine Science Tools | 14108-09 | ||
Sharp, curved scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
Large, serrated forceps | Fine Science Tools | 1106-12 | ||
PE160 suction tubing | BD | 427430 | ||
Clippers | MWI | 21608 | ||
Skin staples/stapler | Ethicon | PRR35 | ||
General supplies: | ||||
Stir plates | ||||
0.1 M HCl | ||||
1 M NaOH | ||||
10x PBS | ||||
1x PBS | ||||
70% Ethanol | ||||
0.1 mL syringes | ||||
10 mL syringe | ||||
Q-tips | ||||
Surgical glue | ||||
Surgical drape | ||||
Towel clamps | ||||
Small hand-held vacuum |