Summary

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval

Published: September 29, 2010
doi:

Summary

Drosophila melanogaster larvas fornecer um modelo de sistema ideal para investigar os mecanismos de transporte axonal dentro larval nervos segmentares. Usando este procedimento, 3 de larvas portadores de mutações diferentes podem ser comparadas às larvas do tipo selvagem.

Abstract

Drosophila melanogaster está emergindo como um sistema poderoso modelo para estudar o desenvolvimento e função do sistema nervoso, particularmente por causa de sua genética e conveniente genoma completamente seqüenciado. Além disso, o sistema nervoso das larvas é um sistema modelo ideal para estudar mecanismos de transporte axonal como os nervos larval segmentar contêm feixes de axônios com seus corpos celulares localizados dentro do cérebro e os seus terminais terminação nervosa ao longo do comprimento do corpo. Aqui nós descrevemos o procedimento para a visualização de proteínas dentro das vesículas sinápticas larval nervos segmentares. Se feito corretamente, todos os componentes do sistema nervoso, juntamente com tecidos associados, tais como músculos e NMJs, permanecem intactas, não danificadas, e pronto para ser visualizado. 3 º larvas carregando várias mutações são dissecados, fixo, incubado com anticorpos das vesículas sinápticas, visualizados e comparados com larvas do tipo selvagem. Este procedimento pode ser adaptado para vários diferentes anticorpos synaptic ou neuronal e as mudanças na distribuição de uma variedade de proteínas pode ser facilmente observado dentro larval nervos segmentares.

Protocol

1. Preparação dos Reagentes Prepare 1x tampão Dissecção com 128 mM NaCl, 4 mM CaCl 2, 4mm MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5mM e Sacarose 36mm. PH da solução a 7,2 e filtro de esterilizar. Prepare o fixador utilizando 01:01 diluição de formaldeído 16% e solução tampão 1x Dissection. Prepare 1x PBT usando 1x Tampão fosfato salino (PBS) em um PH de 7,2 e Triton X-100 em uma proporção de 1:100. Prepare 5% albumina sérica bovina (BSA) com 0,01% Na Azida …

Discussion

Os nervos Drosophila larval segmentares são um poderoso sistema para estudar mecanismos de transporte axonal. Se o 3 º instar larval dissecção é realizada corretamente, todos os componentes do SNC, SNP e tecidos associados, tais como os músculos e NMJs, pode ser examinado dentro de uma larva único. Nós adaptamos este protocolo a partir do que foi publicado por Hurd e Saxton (1996). Este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronal, mas a otimização de anticorpo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SG é apoiado por fundos da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo e de John R. Oishei Foundation.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Dumont #5 Forceps   Fine Science Tools, Inc. 11252-20  
Minutien Pins, Stainless Steel   Fine Science Tools, Inc. 26002-10  
Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors   Fisher Scientific 50822236  
Vectashield, Mounting Medium   Vector Laboratories, Inc. H-1000  
Sylgard 184 Silicone elastomer   Dow Corning Corporation 4026148  
formaldehyde, 16%   Electron Microscopy Sciences 15710  
dCSP3   Developmental Studies Hybridoma Bank    
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG   Invitrogen A-11004  

References

  1. Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
  2. Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
  3. Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. 유전학. 144 (3), 1075-1085 (1996).
  4. Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).

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Cite This Article
Fye, S., Dolma, K., Jung Kang, M., Gunawardena, S. Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations. J. Vis. Exp. (43), e2128, doi:10.3791/2128 (2010).

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