マウスB細胞を精製における誘導とクラススイッチ組み換えの評価
Summary
抗原曝露後、活性化B細胞の亜集団は、異なるエフェクター機能を有する抗体のアイソタイプを生成するためにクラススイッチ組み換え（CSR）として知られているプロセスを経る。このレポートに記載されているプロトコルは、CSRを誘導して分析できる方法について説明します。<em> in vitroで</em> B細胞機能を研究の目的のために。
Abstract
体液性免疫はB細胞によって維持されると抗体の分泌を介して免疫系の分岐です。 B細胞の活性化により、免疫グロブリンの遺伝子座は、結合能と分泌される抗体のエフェクター機能を変更するために遺伝的改変のシリーズを受ける。このプロセスは、デフォルトのIgM抗体のアイソタイプがIgG抗体は、IgA、またはIgEのいずれかに置換されているクラススイッチ組み換え（CSR）として知られているゲノムの組換え事象によって強調表示されます。それぞれのアイソタイプは、それによって免疫の維持にCSRが重要な意思異なるエフェクター機能を持っています。
免疫グロブリン遺伝子座の多様化は、酵素活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）によって媒介される。詳細にこのプロセスを説明する回路図ビデオがオンラインで入手可能（http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html）です。 AIDの活動とCSRの経路は、一般的にB細胞の機能とマウスにおける液性免疫の評価で検討されています。このレポートに記載されているプロトコルは、IgG3（他の抗体アイソタイプについては表1を参照）に切り替えるクラスを誘導する細菌のリポ多糖（LPS）をマウス脾臓とその後の刺激からのB細胞の単離の方法を提示。さらに、蛍光細胞染色色素カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）が刺激された細胞の細胞分裂、スイッチング1、2をアイソタイプに重要なプロセスを監視するために使用されます。
AIDとCSRが発生するメカニズムの規制はまだ明らかではないため、in vitroでのクラススイッチのアッセイで 、様々なマウスモデルでこれらのプロセスをテストするための信頼性の高い方法を提供する。これらのアッセイは、以前は次のノックアウトマウス3を用いて遺伝子の欠損のコンテキストで使用されている。さらに、B細胞のスイッチングのin vitroでのRNAノックダウンまたは導入遺伝子の発現4-6に遺伝子発現を調節するためにウイルスの伝達を付けることができます。実験のこれらのタイプからのデータは、AIDの活動、CSRの反応の解像度、およびマウスにおける抗体媒介性免疫の理解に影響を及ぼしている。
Protocol
Discussion
上記で概説プロトコルは、プライマリマウスB細胞のクラススイッチの間にAIDの発現と機能を解析する標準的なアッセイを提供する。刺激のメディアへの変更は、他のアイソタイプ（表1 8、9に示す）に切り替える誘導できるものはありますが、このプロトコルでは、IgMからIgG3にするためにスイッチング誘導する細菌のLPSを使用しています。
我々がいることを指摘…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は有用な議論のためのマーティンの研究室に感謝しています。この出版物は、保健研究のカナダ研究所（MOP – 89783）からの助成金によってサポートされています。 AMは、カナダのリサーチチェアティアII賞でサポートされています。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
References
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