אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine
Summary
בעקבות חשיפה לאנטיגן, מופעל subpopulations של תאים B עוברים תהליך הידוע בשם רקומבינציה לעבור מחלקה (CSR) כדי לייצר נוגדנים isotypes עם מפעיל פונקציות שונות. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מסביר כיצד CSR יכול להיגרם ונותחו<em> במבחנה</em> לצורכי לימוד פונקציה B התא.
Abstract
חסינות הלחות היא ענף של המערכת החיסונית ומתוחזק על ידי תאים B ו מתווכת באמצעות הפרשה של נוגדנים. עם הפעלת תא B, מוקד אימונוגלובולינים עוברת סדרה של שינויים גנטיים כדי לשנות את קיבולת מחייב מפעיל פונקציה של נוגדנים מופרשים. תהליך זה מודגש על ידי אירוע רקומבינציה גנטי המכונה רקומבינציה בכיתה מתג (CSR) שבו IgM מחדל אלוטיפ נוגדן הוא החליף את אחד IgG, IgA או IgE. אלוטיפ כל בעל פונקציות שונות ובכך מפעיל אחריות חברתית חיונית לשמירה על חסינות.
גיוון של מוקד אימונוגלובולינים מתווכת על ידי דאמינז הפעלה-Induced cytidine אנזים (AID). וידאו סכמטי המתאר את התהליך בפירוט זמינה באופן מקוון (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). פעילות של סיוע מסלול CSR נלמדים בדרך כלל הערכה של תפקוד התא B ו חסינות הלחות בעכברים. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מציג שיטה של בידוד תא B מ spleens Murine וגירוי לאחר מכן עם lipopolysaccharide חיידקי (LPS) כדי לגרום מעמד מעבר IgG3 (עבור isotypes נוגדנים אחרים ראו טבלה 1). בנוסף, מכתים פלורסנט התא לצבוע Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) משמש כדי לפקח על חלוקת התא של תאים מגורה, תהליך חיוני אלוטיפ מיתוג 1, 2.
הסדרת הסיוע את המנגנון שבאמצעותו CSR מתרחשת עדיין אינם ברורים ולכן בבורר מבחני חוץ גופית בכיתה לספק שיטה אמינה לבדיקת תהליכים אלה במודלים של עכברים שונים. מבחני אלו שימשו בעבר בהקשר של חוסר גנטי באמצעות עכברים knockout 3. יתר על כן, במבחנה מיתוג של תאים B יכול להיות קדמו התמרה ויראלית לווסת ביטוי גנים על ידי מציאה RNA או ביטוי transgene 4-6. נתונים אלו סוגים של ניסויים השפיעו ההבנה שלנו של פעילות AID, ברזולוציה של התגובה CSR, ואת הנוגדנים בתיווך חסינות העכבר.
Protocol
Discussion
פרוטוקול שתוארו לעיל מספק assay תקן לנתח ביטוי סיוע לתפקד במהלך מיתוג המעמד העיקרי של תאים B Murine. פרוטוקול זה משתמש LPS בקטריאלי כדי לגרום מעבר מ IgM כדי IgG3, למרות שינויים בתקשורת הגירוי יכול להתבצע לגרום מעבר isotypes אחרים (מסוכמים בטבלה 1 8, 9).
<p class="jove_content" style=";text-align:rig…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים במעבדה מרטין לדיונים מועילים. פרסום זה נתמך על ידי מענק מטעם המכון הקנדי לבריאות מחקר (MOP-89783). AM הוא נתמך על ידי פרס קנדה מחקר הקתדרה המשני.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
References
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
