ウイルス感染に関与する新規の宿主因子は、機能のRNAiスクリーニングの細胞ベースのゲノムワイドな損失を介して識別できます。 A<em>ショウジョウバエ</em>細胞培養モデルでは、RNAi実験の容易さと効率のためにこのアプローチに特に適している。ここでは、使用してこのテクニックを示しています<em>ワク</em例として>ウイルス。
だけでなく、ウイルスは、ヒトの病気の自然な流行を引き起こす可能性がありますが、バイオテロの潜在的な利用も懸念される。ウイルス性病原体は、重大な公衆衛生上の脅威を表す。衝撃の感染が待望の治療薬の開発を促進することを細胞因子の理解を深める。いくつかの生物の塩基配列の完全なゲノムとの結合RNA干渉(RNAi)技術の最近の進歩により、ゲノムワイドな、セルベースの機能喪失の画面の最適化につながっている。 ショウジョウバエの細胞ためのゲノムスケールの画面には特に敏感に反応このシステム1におけるRNAiの使いやすさと効率性。重要なのは、ウイルスの多種多様な医療や農業の大切さ2,3,4の哺乳類のウイルスの数を含む、 ショウジョウバエの細胞を、感染することができます。 ショウジョウバエの前のRNAiスクリーニングは、エントリ、翻訳とRNA複製5を含むウイルス感染におけるさまざまなステップに必要な宿主因子を同定した。また、 ショウジョウバエの細胞培養でウイルス複製に必要な細胞因子の多くは、これらのウイルス4,6,7,8、9に感染したヒトの細胞に制限されています。したがって、ウイルス感染時の共存を選んだ宿主因子の同定は、抗ウイルス治療のための新しいターゲットを示します。ここでは例として、 ワクシニアウイルスを使用して、ウイルス感染に関与する細胞因子を特定するハイスループットRNAiスクリーニングのための一般的なプロトコルを提示する。
ショウジョウバエのゲノムワイドなRNAiスクリーニングでは、ウイルス感染の細胞成分を調べるための、堅牢で効率的な方法を提供する。哺乳類のウイルスの数は、ホスト固有の免疫応答の構成要素を識別するために使用できるショウジョウバエの細胞を、感染、および新たな治療標的を表す可能性があるウイルス複製に必要なタンパク質因子を開催。画面を実行する前に、アッセイは、慎重に細胞型、細胞数、および感染のレベルに合わせて最適化しなければならない、とも正と負のウイルスおよび細胞標的11の両方を含む、制御しなければならない。アッセイのダイナミックレンジを最大にする前にスクリーニングにポジティブコントロールとネガティブコントロールとの間の十分な分離を確保することが重要です。画面が実行されたら、候補者は、ホストのメカニズムは、感染症に寄与するかを決定するために機能的なカテゴリに分けることができます。 ワクシニアなどの哺乳動物ウイルスの場合は、RNAiによる哺乳動物のホモログの寄与は、二次分析の一環として決定されるべきである。一緒に、これらの堅牢なスクリーニング法は、私たちは、ウイルスが宿主細胞と相互作用することによって、複雑なメカニズムを把握することができます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、NIAID(R01AI074951、U54AI057168)とSCにペンゲノムフロンティア研究所からの補助金によって支えられて、NIH T32HG000046からTSMに、NIH T32GM07229とT32AI007324からLRSに。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Cell culture | ||||
Schneider’s media | GIBCO | 11720 | ||
GlutaMAX 100X | GIBCO | 35050 | ||
Penicillin/streptomycin (pen/strep) | GIBCO | 15140 | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | SIGMA | F6178 | ||
Screening | ||||
Genome-wide dsRNA library | Ambion | |||
384 well plates, black with clear bottom | Corning | 3712 | ||
Aluminum seals | Corning | 6569 | ||
Clear seals | Denville | B1212-4 | ||
Well Mate | Matrix | 201-10001 | ||
24 pin manifold | Drummond | 3-000-101 | ||
Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | ||
Fluorescently-labeled secondary antibodies | Invitrogen | |||
ImageXpressMicro automated microscope | Molecular Devices | |||
MetaXpress image analysis software | Molecular Devices |