Intrakraniell Injektion av Adeno-associerad virala vektorer
Summary
Här presenterar vi de intrakraniella injektion av AAV vektorer för fluorescerande märkning av nervceller och Glia i syncentrum.
Abstract
Intrakraniell injektion av virala vektorer konstruerad för att uttrycka en fluorescerande proteinet är en mångsidig märkning teknik för visualisering av specifika undergrupper av celler i olika områden i hjärnan både in vivo och i hjärnan sektioner. Till skillnad från injektion av fluorescerande färger, erbjuder virus märkning inriktning av enskilda celltyper och är billigare och tidskrävande än upprättandet transgen mus linjer. Med den här tekniken är en Adeno-associerad viral (AAV) vektor injiceras intracranially med stereotaxic koordinater, en mikropipett och en automatisk pump för exakt leverans av AAV till önskat område med minimal skada på omgivande vävnad. Injektion parametrar kan skräddarsys för enskilda experiment genom att anpassa djuret ålder vid injektion, injektionen plats, volym injektion, infusionshastighet, AAV serotyp och initiativtagaren körning genuttryck. Beroende på vald förhållanden kan viralt inducerad transgenen uttryck tillåter visualisering av grupper av celler, enskilda celler eller fina cellulära processer, ner till nivån Dendritutskotten. Experimentet visas här skildrar en injektion av dubbel-strängat AAV uttrycker grönt fluorescerande protein för märkning av nervceller och Glia i musens primära syncentrum.
Protocol
Discussion
Viralt-medierad gen leverans innebär stora möjligheter för att studera neurologiska processer och behandling av sjukdomar i hjärnan 1,2,3. Den stora mångsidigheten hos denna teknik kan också utnyttjas för att fluorescerande etikett celler för avbildning både in vitro och in vivo 4. Här visar vi ett detaljerat förfarande för transduktion av nervceller och Glia i mus syncentrum med en dubbel-strängat Adeno-föreningen virus som uttrycker förbättrade grönt fluorescera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har möjliggjorts genom anslag från NIH (EY012977), en karriär Award i biomedicin från Burroughs Wellcome Fund, Whitehall Foundation och Sloan Foundation (AKM).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | ||
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | ||
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill | |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | ||
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR International/ Drummond | 5-000-1001 or 53480-287 | ||
| Mineral oil | VWR International | 29447-338 | ||
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates | |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | ||
| Sutures | VWR International | 95056-952 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
References
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O’Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
