Summary

Toll様受容体の活性化を調節するのNeu1シアリダーゼ活性の検出

Published: September 07, 2010
doi:

Summary

シアリダーゼのアッセイは、微生物感染と生マクロファージの細胞表面の受容体レベルでの炎症性疾患への関与のTLRセンサの新しい分子機構(s)を解明する簡単な技術的なアプローチです。

Abstract

哺乳類のToll様受容体(TLR)は病原体関連分子パターンを認識する受容体ファミリーです。だけでなく、TLRは微生物の重要なセンサー(例えば、ウイルス、細菌および寄生虫)感染症である、彼らはまた、おそらく自己免疫疾患で感染症、炎症性疾患、との病態生理に重要な役割を果たす。このように、感染症に対するTLR応答の強度と持続時間は厳密に管理する必要があります。それはセンサーの受容体の構造的完全性を理解すること、次の、そのリガンドの相互作用とシグナル伝達成分は、その後の免疫学的防御のために不可欠です。また、センサーの操作による疾患修飾のための重要な機会を提供するであろう。 TLRのセンサーのシグナル伝達経路はよく特徴付けされていますが、センサーとそのリガンドとの相互作用を制御するパラメータは、まだ明らかにされないままである。我々は最近、以前に1,2を観察されていない、その天然のリガンドによるTLRの活性化の新たなメカニズムを同定した。それは、リガンド誘導TLRの活性化が密接にNeu1シアリダーゼの活性化によって制御されていることを示唆している。我々はまたNeu1がしっかりNeu1とマトリックスメタロプロテイナーゼ-9(MMP – 9)受容体4との複合体におけるクロストークを含むであるTrkAとTrkB 3などのニューロトロフィン受容体に、調節していることを報告している。シアリダーゼのアッセイは、最初はGPCRGαiタンパク質およびMMP – 9の5を介してマクロファージ、樹状細胞と線維芽細胞の細胞表面上Neu4シアリダーゼの活性化で、小説リガンド、thymoquinoneを見つけるために使用されています。 TLR受容体のために、我々のデータはNeu1シアリダーゼはTLR – 2、-3および-4受容体との複合体に既に存在し、いずれかの受容体へのリガンドの結合によって誘導されることを示している。 TLR – 4量体化、MyD88/TLR4複​​雑な募集、NFkBの活性化​​および炎症誘発性細胞応答に立体障害を除去するために結合するリガンドから遠いNeu1シアリダーゼ加水分解シアリルα- 2、3 – リンクされているβ-ガラクトシル残基を活性化。共同報告書では、Neu1シアリダーゼはマクロファージの細胞6食作用を調節することが示されている。一緒になって、シアリダーゼのアッセイは、リガンド誘導性受容体の活性化の分子メカニズムへの強力な洞察を提供してくれました。 Neu1シアリダーゼとTLRの活性化との間の正確な関係は、TRK受容体がまだ完全に解明されているものの、それは細胞調節経路に新しいまたは先駆的なアプローチを表すことになります。

Protocol

1。復活冷凍マクロファージ細胞 -80℃冷凍庫から凍結細胞を復活させる前に、人は10%ウシ胎児血清(FBS)とplasmocin 5μg/ mLのを補充した滅菌濾過したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)を用いて培養液を準備する必要があります。 Plasmocinは、細胞培養のマイコプラズマ汚染を排除し、防止するために私たちの研究で使用される抗生物質溶液です。 凍結細胞の1バイアルの場合、…

Discussion

ライブマクロファージ細胞2でシアリダーゼ活性を検出するために新しく開発されたアッセイを使用して、我々としても、ライブDC – 2.4樹状細胞の用量依存的にライブBMC – 2マクロファージ細胞におけるリガンド誘発性シアリダーゼ活性のシアリダーゼ活性を検出するためにこの技術を使用し、HEK-TLR4/MD2、HEK293、SP1乳腺腺癌細胞、ヒトWTおよび1140F01とWG0544 I型sialidosis線維芽細胞。タミフ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MRSへの補助金によって部分的なサポートはカナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)、神経科学研究のためのハリーBotterell財団、ARC、およびガーフィールドケリー循環器の研究開発基金からのものです。 SRAは、クイーンズ大学の研究賞とロバートJ.ウィルソンフェローシップの受賞者です。 PJは、女王の大学院賞、ロバートJ.ウィルソンフェローシップの受賞者です。 AGとSAは、女王の大学院賞の受賞者です。 SFは科学技術(OGSST)のオンタリオ大学院奨学金の受け手だった。 AGは、女王のフランクリンブラッケン大学院奨学金の受取人です。 SAは、女王のRS McLaughlinは大学院奨学金の受取人です。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DMEM   Gibco, Rockville, MD    
4-MUNANA   Biosynth International Inc., Itasca, IL, USA    
Fetal calf serum   HyClone, Logan, Utah, USA    
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media   DAKO North America, Inc., Carpintenia, CA S3023 15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)   Hoffman La Roche    

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Cite This Article
Amith, S. R., Jayanth, P., Finlay, T., Franchuk, S., Gilmour, A., Abdulkhalek, S., Szewczuk, M. R. Detection of Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation. J. Vis. Exp. (43), e2142, doi:10.3791/2142 (2010).

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