sialidase 분석은 미생물의 감염 라이브 macrophages의 세포 표면에 수용체 수준에서 염증성 질환에 관여 TLR 센서 소설 분자 메커니즘 (들)을 명료하게하다하는 간단한 기술 접근이다.
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방법 논문
수신자 같은 수용체 활성화 레굴라팅에 Neu1 Sialidase 활동 감지
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
포유류의 수신자 같은 수용체 (TLRs)는 병원균 - 관련 분자 패턴을 인식 수용체의 가족입니다. 뿐만 아니라 TLRs는 미생물의 중요한 센서 (예, 바이러스, 세균 및 기생충) 감염되며, 그들은 또한 가능성이 면역 질환으로 전염성 질환, 염증 질환, 그리고 pathophysiology에 중요한 역할을한다. 따라서, 감염증에 대한 TLR의 반응의 강도와 기간은 강력히 제어해야합니다. 이 센서 수용체들은 리간드 상호 작용과 신호 구성 요소의 구조적 무결성을 이해하는 것은 이후의 면역 보호를 위해 필수적인 것이 다음과 같습니다. 또한 센서 조작을 통해 질병 조작을위한 중요한 기회를 제공합니다. TLR 센서의 신호 경로가 잘 묘사되고 있지만, 매개 변수는 센서와 그 리간드 여전히 저조한 정의 남아 사이의 상호 작용을 통제. 우리는 최근 이전에 1,2을 관찰되지 않은 자연 리간드에 의해 TLR 활성화의 소설 메커니즘을 확인했습니다. 그것은 리간드 유도된 TLR 활성화가 밀접하게 Neu1 sialidase 활성화에 의해 제어됩니다 것을 제안합니다. 우리는 또한 Neu1가 단단히 Neu1 및 매트릭스 metalloproteinase - 9 (MMP - 9) 수용체 4 단지에 간 이야기를 포함 TrkA와 TrkB 3 번 neurotrophin 수용체를 조절보고있다. sialidase 분석 처음 GPCR Gαi 단백질 및 MMP - 9 5를 통해 macrophages, 돌기 세포 fibroblast 세포의 세포 표면에 Neu4 sialidase의 활성화에 새로운 리간드, thymoquinone를 찾을 사용되었습니다. TLR 수용체에 대한 우리의 데이터는 Neu1 sialidase는 TLR - 2, -3 및 -4 수용체 복잡한 이미이며, 두 수용체에 리간드 바인딩에 유도되고있는 것으로 나타났습니다. 활성 Neu1 sialidase의 hydrolyzes sialyl α - 2 TLR - 4 dimerization, MyD88/TLR4 복잡한 채용, NFkB의 활성화와 프로 염증성 세포 반응에 steric hinderance를 제거하는 바인딩 리간드에서 멀리 ,3 - 링크 β - galactosyl 잔류물. 공동 보고서에서 Neu1의 sialidase는 대식 세포 세포 6 phagocytosis 조절을 보여줘왔다. 함께 촬영 sialidase 분석은 리간드 유도된 수용체 활성화의 분자 메커니즘에 강력한 통찰력으로 우리를 제공합니다. Neu1 sialidase과 TLR의 활성화 사이의 정확한 관계가, Trk 수용체는 아직 완전히 elucidated 수 있지만, 그것은 세포 규제 경로에 신규 또는 선구적인 접근 방식을 나타내는 것입니다.
프로토콜
1. 냉동 세포 대식 세포의 세포를 부활
- -80에서 냉동 세포를 부활하기 전에 ° C 냉장고 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 5 μg / plasmocin의 ML과 보충 살균 필터 Dulbecco의 수정된 이글의 중간 (DMEM)을 사용하여 배지를 준비 하나 필요합니다. Plasmocin은 세포의 문화 mycoplasma 오염을 제거하고 방지하기 위해 우리의 연구에 사용되는 항생제 솔루션입니다.
- 냉동 세포 중 하나가 병에 들어, 4 ML, 살균 생물 학적 봉쇄 후드에서 25cm 2 세포 배양 플라스크에 교양 매체 1 ML을 추가합니다.
- 냉동 세포의 유리병은 -80 ° C의 냉동고에서 가져온 경우, 그들은 빠르게 약 2-3 분 소요 멸균 후드에 손 온난화에 의해 해동됩니다.
- 즉시 세포가 해동되면서, 그들은 신속하게 1mL 피펫을 사용하여 살균 시설이 매체를 포함하고있는 술병으로 전송됩니다.
- 세포를 포함하는 플라스크는 37 ° C와 5% CO 2에서 조직 문화 인큐베이터에 배치됩니다.
- 그들이 거꾸로 현미경을 사용하여 75 % 90% 합류가 될 때까지 세포는 매일 성장과 준수를위한 검사.
- 세포 배양 보육 동안, 12mm 원형 ....
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토론
라이브 대식 세포 세포 2 sialidase 활동을 감지하기 위해 새로 개발된 분석을 사용하여, 우리는 BMC - 2 복용량에 의존 방식으로뿐만 아니라 사는 대식 세포의 세포 DC - 2.4 돌기 세포에 거주 리간드 유도된 sialidase 활동에 sialidase 활동을 감지하는이 기술을 사용 , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 내유 선암 세포, 인간 WT 및 1140F01 및 WG0544 종류 I sialidosis의 fibroblast 세포. Tamiflu (oseltamivir 인산염)과 같은 Neuraminidase 억제제는 IC 50 0.0194의 μm의와 함께 BMC - 2 세포가 neuraminidase 억제제 데이 (2 - 데옥시 - 2 ,3 - dehydro위한 19.17 μm의의 IC 50와 비교하여 사는 thymoquinone 유발 sialidase 활동을 저해 DN - acetylneuraminic 산성) 5. .......
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공개 사항
SRA와 PJ 똑같이 첫번째 저자로 기여.
감사의 글
MRS을 부여하여 부분 지원 자연 과학, 캐나다 공학 연구 협의회 (NSERC), 신경 과학 연구, ARC에 대한 해리 Botterell 재단, 그리고 가필드 켈리 순환기 연구 및 개발 기금에서입니다. SRA는 여왕의 대학 연구 대상과 로버트 J. 윌슨의 원정받는 사람입니다. PJ는 여왕의 졸업 수상과 로버트 J. 윌슨의 원정받는 사람입니다. AG와 SA는 여왕의 대학원 수상 수상자입니다. SF는 과학 기술 (OGSST)에서 온타리오 대학원 장학금받는했다. AG는 여왕의 프랭클린 브래켄 대학원 장학금받는 것입니다. SA는 여왕의 RS 맥롤린 대학원 장학금받는 것입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 4-MUNANA | Biosynth International, Inc | ||
| 태아 송아지 혈청 | Hyclone | ||
| DakoCytomation, 형광 마운팅 매질 | Dako | S3023 | 15 mL |
| 타미플루 (Oseltamivir Phosphate) | Hoffmann-La Roche AG |
참고문헌
- Amith, S. R. Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling. Cell Signal. 22, 314-324 (2010).
- Amith, S. R.
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재인쇄 및 허가
