Isolatie en Cultuur van Aviaire Embryonic Valvulaire Progenitor Cellen

Summary

Dit artikel geeft een methode voor het isoleren en kweken van kwartels of kippen HH14^- Klep endocardiale cellen en HH25 klep kussen mesenchymale cellen.

Abstract

Een goede vorming en functie van de embryonale hartkleppen is van cruciaal belang voor de ontwikkeling progressie. De vroege embryonale hart is een U-vormige buis van endocard, omringd door myocard. Het myocard scheidt cardiale gelei, een hyaluronan-rijke gelatineuze matrix, in de atrioventriculaire (AV) knooppunt-en uitstroom-darmkanaal (OFT) lumen. In fase HH14 valvulogenesis begint als een subset van de endocardiale cellen signalen van de hartspier ontvangen, ondergaan endocardiale naar mesenchymale transformatie (EMT), en binnen te vallen de cardiale gelei. In fase HH25 de hartkleppen kussens zijn volledig mesenchymalized, en het is deze mesenchym dat uiteindelijk vormt de klep en het septum apparaat van het hart. Inzicht in de mechanismen die initiëren en moduleren het proces van EMT en de celdifferentiatie zijn belangrijk vanwege hun verbinding met ernstige aangeboren hartafwijkingen. In deze studie presenteren we methoden om de pre-EMT endocardiale en post-EMT mesenchymale cellen, die de twee verschillende cel fenotypes van de prevalvular kussen te isoleren. Pre-EMT endocardiale cellen kunnen worden gekweekt, met of zonder het myocard. Post-EMT AV kussen mesenchymale cellen kunnen worden gekweekt in mechanisch beperkt of stress-vrij collageen gels. Deze 3D in vitro modellen bootsen de belangrijkste valvulaire morfogenisch gebeurtenissen en zijn nuttig voor deconstructie van de mechanismen van de vroege en late stadium valvulogenesis.

Protocol

1. Voorbereiding Incubeer vruchtbare kwartels of kippen eieren naar de derde fase 14 – (ongeveer 2 dagen) of 25 (ongeveer 4,5 dag) bij 60% luchtvochtigheid en 37 ° C. Bereid steriele Earl's Balanced Salt Solution (EBSS) Voeg 100 ml 10x EBSS tot 600 ml water 18 MΩ Voeg 2,2 g natriumbicarbonaat Breng de pH van de oplossing tot 7,2 Breng de oplossing tot 1000 ml Steriliseer de oplossing door het passeren door een 0,2 um filter …

Discussion

De methode voor het isoleren van endocardiale cellen uit stadium HH14 ^– harten oorspronkelijk ontwikkeld door Runyan en Markwald zorgt voor een gecontroleerde, in vitro omgeving om de factoren die initiëren en moduleren embryonale EMT ^2-studie. HH14 ^– endocardiale explantaten gekweekt zonder myocard zal niet ondergaan EMT zonder biomechanische of biochemische interventie. Als het myocard is links op de explantatie zal het signaal een subset van de endocardiale cellen om mesench…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Extra fine Bonn scissors, curved		Fine Science Tools	14085-08
Dumont tweezers #55		World Precision Instruments, Inc.	14099
Dumont tweezers #5		World Precision Instruments, Inc.	14098
Sterile transfer pipettes		Samco Scientific	2041S
4-well culture plates		Nunc	176740
Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane		Nalgene	566-0020
Sterile 15 mL centrifuge tubes		Corning	430828
Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm		VWR International	25384-342
Laboratory tape		VWR International	89097-920
Rat-tail collagen I		BD Biosciences	354236
10X Earl’s Balanced Salt Solution		Quality Biological, Inc.	119-064-131
M199 powder		Invitrogen	31100-035
Penicillin-Streptomycin		Invitrogen	15140-122
Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)		Invitrogen	41400-045
Chicken serum		Invitrogen	16110-082
0.25% Trypsin-EDTA		Invitrogen	25200-056
Sodium bicarbonate		Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide solution, 1.0 N		Sigma-Aldrich	S2770
Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)		Lake Cumberland Game Bird Farm
Fertile chicken eggs (Gallus gallus)		Cornell University Poultry Farm