Isolement et culture de cellules progénitrices embryonnaires aviaires valvulaire
Summary
Cet article propose une méthode pour isoler et cultiver la caille ou de poulet HH14<sup> -</sup> Soupape de cellules endocardiques et HH25 cellules mésenchymateuses coussin de soupape.
Abstract
Bonne formation et la fonction des valves cardiaques embryonnaires humaines est indispensable à la progression du développement. Le coeur embryonnaire précoce est un tube en U de l'endocarde entouré par myocarde. Le myocarde sécrète cardiaques gelée, une matrice riche en acide hyaluronique gélatineux, dans le auriculo-ventriculaire (AV) de jonction et des voies d'écoulement (OFT) lumen. Au stade HH14 valvulogenesis commence quand un sous-ensemble de cellules endocardiques recevoir des signaux du myocarde, l'endocarde subissent à la transformation mésenchymateuse (TEM), et envahissent la cardiaques gelée. Au stade HH25 les coussins valvulaires sont entièrement mesenchymalized, et c'est ce mésenchyme qui forme éventuellement l'appareil valvulaire et septale du cœur. Comprendre les mécanismes qui déclenchent et modulent les processus de différenciation cellulaire et l'EMT sont importantes en raison de leur connexion à de graves malformations cardiaques congénitales. Dans cette étude, nous présentons les méthodes pour isoler pré-EMT endocardique et post-EMT cellules mésenchymateuses, qui sont les deux phénotypes cellulaires différents du coussin prevalvular. Pré-EMT cellules endocardiques peuvent être cultivées avec ou sans le myocarde. Post-EMT cellules mésenchymateuses coussin AV peuvent être cultivées à l'intérieur des gels de collagène mécaniquement contraint ou sans stress. Ces 3D dans des modèles in vitro imitent les principaux événements morphogéniques valvulaire et sont utiles pour déconstruire les mécanismes de valvulogenesis stade précoce et tardive.
Protocol
Discussion
La méthode pour isoler les cellules endocardiques du stade HH14 – coeurs initialement développé par Runyan et Markwald fournit un environnement contrôlé, dans un environnement in vitro pour étudier les facteurs qui déclenchent et modulent embryonnaire EMT 2. HH14 – explants endocardique cultivées sans myocarde ne subira pas d'EMT sans intervention biomécaniques ou biochimiques. Si le myocarde est à gauche sur l'explant il signalera un sous-ensemble de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche est soutenue par la Fondation Hartwell, l'American Heart Association (Scientist Development Grant # 0830384N) et la Fondation Leducq: 07CVD04 mitrale.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | ||
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | ||
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific | 2041S | ||
| 4-well culture plates | Nunc | 176740 | ||
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalgene | 566-0020 | ||
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR International | 25384-342 | ||
| Laboratory tape | VWR International | 89097-920 | ||
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | ||
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | ||
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | ||
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | ||
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | ||
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | |||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. 발생학. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. 발생학. 302, 256-256 (2007).
