鳥類胚弁膜前駆細胞の単離と培養
Summary
この記事では、単離するための方法および培養ウズラやニワトリHH14を提供します<sup> -</sup>弁心内膜細胞とHH25バルブクッション間葉系細胞。
Abstract
胚の心臓弁の適切な形成と機能は、発達の進行に重要です。初期胚の心臓は心筋に囲まれた心内膜のU字型チューブです。心筋分泌心臓ゼリー、ヒアルロン酸が豊富なゼラチン状のマトリックス、房室（AV）ジャンクションと流出路（OFT）腔へ。段階でHH14 valvulogenesisは心内膜細胞のサブセットは、間葉転換（EMT）への心内膜心筋からの信号を受ける受信、および心臓のゼリーに侵入するところから始まります。段階HH25で弁膜クッションは完全にmesenchymalized、そしてそれは最終的に心臓の弁膜症と中隔装置を形成するこの間充織であるされています。 EMTと細胞分化のプロセスを開始し、調節するメカニズムを理解するために重篤な先天性心疾患への接続が重要です。本研究では、prevalvularクッションの2つの異なる細胞表現型であるプレEMT心内膜とポストEMT間葉系細胞を単離する方法を提示する。プレEMT心内膜細胞が心筋の有無に関係なく培養することができる。ポストEMT AVクッション間葉系細胞は内部に機械的制約やストレスのないコラーゲンゲルを培養することができる。 in vitroモデルこれらの3Dは、主要な弁の形態形成のイベントを模倣し、初期および後期のvalvulogenesisのメカニズムを解体するのに便利です。
Protocol
Discussion
ステージHH14から心内膜細胞を単離する方法–もともとラニアンとMarkwaldによって開発された心臓は、胚性EMT 2を開始し、変調の要因を研究するためのin vitro環境で 、制御を提供します。 HH14 –心筋なしで培養した心内膜片は、生体力学的または生化学的な介入なしにEMTを起こさない。心筋が植片上に残っている場合、それは間葉転換を受けるために心内膜細…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
僧帽弁07CVD04：本研究では、ハートウェル財団、米国心臓協会（サイエンティスト開発グラント＃0830384N）と財団Leducqによってサポートされています。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | ||
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | ||
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific | 2041S | ||
| 4-well culture plates | Nunc | 176740 | ||
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalgene | 566-0020 | ||
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR International | 25384-342 | ||
| Laboratory tape | VWR International | 89097-920 | ||
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | ||
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | ||
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | ||
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | ||
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | ||
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | |||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. 발생학. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. 발생학. 302, 256-256 (2007).
