조류 배아 판막병 전구 세포의 분리 및 문화
Summary
이 문서는 분리를위한 방법과 culturing 퀘일 또는 닭고기 HH14를 제공합니다<sup> -</sup> 밸브 endocardial 세포와 HH25 밸브 쿠션 mesenchymal 세포.
Abstract
배아 심장 밸브의 올바른 형성과 기능은 개발 진행을 위해 중요합니다. 초기 배아 심장은 myocardium 둘러싸인 endocardium의 U – 모양의 튜브입니다. myocardium secretes 심장 젤리, 방실 (AV) 접합 및 유출 트랙트 (OFT) 루멘으로 hyaluronan 풍부한 젤라틴 매트릭스. 단계에서 HH14 valvulogenesis는 endocardial 세포의 일부가 mesenchymal 변환 (EMT)에 endocardial myocardium의 신호를 받아야 받게하고, 심장 젤리를 침공 때 시작됩니다. HH25 단계에서 밸브 모양의 쿠션을 완전히 mesenchymalized, 그리고 그것은 결국 심장의 밸브 모양의 장치와 septal을 형성하고이 mesenchyme집니다. EMT 및 세포 분화의 과정을 시작하고 조절하는 메커니즘을 이해하는 것은 심각한 선천성 심장 때문에 결함들의 연결 중요합니다. 본 연구에서는 우리는 prevalvular 쿠션의 두 가지 세포 phenotypes 아르 사전 EMT endocardial 및 사후 응급 mesenchymal 세포를 분리하는 방법을 제시한다. 사전 EMT endocardial 세포 또는 myocardium없이 교양 수 있습니다. 포스트 EMT 유명 쿠션 mesenchymal 세포 내부 기계 제약이나 스트레스없는 콜라겐 젤을 배양해 수 있습니다. 체외 모델에서 이러한 3D 주요 밸브 모양의 morphogenic 이벤트를 모방하고 초기 늦게 무대 valvulogenesis의 메커니즘을 deconstructing하는 데 유용합니다.
Protocol
Discussion
무대 HH14에서 endocardial 세포 분리를위한 방법 – 원래 런얀 및 Markwald 개발한 마음은 시작과 배아 EMT 2 조절 요인을 연구하기 위해 체외 환경에서 제어를 제공합니다. HH14 – myocardium하지 않고 교양 endocardial explants가 biomechanical 또는 생화 학적 개입없이 EMT를 받아야하지 않습니다. myocardium가 explant에 남아있다면 그것은 mesenchymal 변화를 받아야하는 endocardial 세포의 하위 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
승모판 07CVD04 :이 연구는 하트웰 재단, 미국 심장 협회 (과학자 개발 권한 부여 # 0830384N) 및 재단 Leducq에 의해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | ||
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | ||
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific | 2041S | ||
| 4-well culture plates | Nunc | 176740 | ||
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalgene | 566-0020 | ||
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR International | 25384-342 | ||
| Laboratory tape | VWR International | 89097-920 | ||
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | ||
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | ||
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | ||
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | ||
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | ||
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | |||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. 발생학. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. 발생학. 302, 256-256 (2007).
