Isolamento e Cultura da Avian embrionárias Células Progenitoras Valvular

Summary

Este artigo irá fornecer um método para isolar e cultura de codorna ou frango HH14^- Células de válvulas do endocárdio e HH25 células mesenquimais válvula de amortecimento.

Abstract

Adequada formação e função das válvulas cardíacas embrionárias é fundamental para a progressão de desenvolvimento. O coração embrionário é um tubo em forma de U do endocárdio cercado por miocárdio. O miocárdio secreta cardíaca geléia, um ácido hialurônico rico em matriz gelatinosa, na junção atrioventricular (AV) e via de saída (OFT) lúmen. No estágio HH14 valvulogênese começa quando um subconjunto de células endocárdicas receber sinais do miocárdio, submetidos à transformação do endocárdio mesenquimais (EMT), e invadir a geléia cardíaca. No estágio HH25 as almofadas valvular são totalmente mesenchymalized, e é esta mesênquima que, eventualmente, as formas do aparelho valvar e septal do coração. Compreensão dos mecanismos que iniciam e modulam o processo de diferenciação celular e EMT são importantes por causa de sua conexão com graves defeitos cardíacos congênitos. Neste estudo, apresentamos métodos para isolar pré-EMT endocárdicas e células mesenquimais pós-EMT, que são os dois fenótipos celulares diferentes da almofada prevalvular. Células pré-EMT endocárdica podem ser cultivadas com ou sem o miocárdio. Pós-EMT células mesenquimais almofada AV podem ser cultivadas géis de colágeno dentro mecanicamente restrito ou livre de estresse. Estas 3D em modelos in vitro imitar os principais eventos da morfogênese valvular e são úteis para desconstruir os mecanismos de valvulogênese estágio precoce e tardia.

Protocol

1. Preparação Incubar codorna fértil ou ovos de galinha para a fase 14 – (cerca de 2 dias) ou 25 (cerca de 4,5 dias) em 60% de umidade e 37 ° C. Preparar a solução de Earl estéril de salina balanceada (EBSS) Adicionar 100 mL EBSS 10X a 600 mL de água 18 mohms Adicionar 2,2 g de bicarbonato de sódio Ajustar o pH da solução para 7,2 Levar a solução até 1000 mL Esterilizar a solução, passando por um filtro de 0,2 mM <…

Discussion

O método para isolar células endocárdicas do estágio HH14 ^– corações originalmente desenvolvido pela Runyan e Markwald fornece um ambiente controlado, in vitro ambiente para estudar os fatores que iniciam e modulam EMT embrionárias ^2. HH14 ^– explantes cultivados endocárdica sem miocárdio não sofrerá EMT sem intervenção biomecânica ou bioquímica. Se o miocárdio é deixado no explante será sinal de um subconjunto de células endocárdicas submeter-se a transforma?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Extra fine Bonn scissors, curved		Fine Science Tools	14085-08
Dumont tweezers #55		World Precision Instruments, Inc.	14099
Dumont tweezers #5		World Precision Instruments, Inc.	14098
Sterile transfer pipettes		Samco Scientific	2041S
4-well culture plates		Nunc	176740
Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane		Nalgene	566-0020
Sterile 15 mL centrifuge tubes		Corning	430828
Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm		VWR International	25384-342
Laboratory tape		VWR International	89097-920
Rat-tail collagen I		BD Biosciences	354236
10X Earl’s Balanced Salt Solution		Quality Biological, Inc.	119-064-131
M199 powder		Invitrogen	31100-035
Penicillin-Streptomycin		Invitrogen	15140-122
Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)		Invitrogen	41400-045
Chicken serum		Invitrogen	16110-082
0.25% Trypsin-EDTA		Invitrogen	25200-056
Sodium bicarbonate		Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide solution, 1.0 N		Sigma-Aldrich	S2770
Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)		Lake Cumberland Game Bird Farm
Fertile chicken eggs (Gallus gallus)		Cornell University Poultry Farm