Kuş Embriyonik Kapak Progenitör Hücreler izolasyonu ve Kültür
Summary
Bu makale, izole etmek için bir yöntem ve kültür bıldırcın veya tavuk HH14 sağlayacak<sup> -</sup> Endokardiyal hücreler vana ve vana yastık HH25 mezenkimal hücreler.
Abstract
Uygun oluşumu ve işlevi embriyonik kalp kapakçıkları, gelişim ilerlemesi için kritik öneme sahiptir. Erken embriyonik kalp miyokard tarafından çevrili endokard U-şeklinde bir tüp. Miyokardın salgılar kardiyak jöle, atriyoventriküler (AV) kavşak ve çıkış yolu (OFT) lümen içine hyaluronan zengin jelatinimsi matriks. Aşamada HH14 valvulogenesis endokardiyal hücrelerinin bir alt kümesi, mezenkimal dönüşüm (EMT) endokardiyal miyokard gelen sinyalleri geçiren alırsınız ve kalp jöle işgal başlar. Sahne HH25, kapak yastıkları tam mesenchymalized ve sonunda kalp kapak ve septal aparat formları bu mezenşimin. EMT ve hücre farklılaşma süreci başlatmak ve modüle mekanizmaların anlaşılması, ciddi konjenital kalp kusurları bağlantısı nedeniyle önemlidir. Bu çalışmada, prevalvular yastık iki farklı hücre fenotipleri-EMT endokardiyal öncesi ve post-EMT mezenkimal hücreler izole yöntemleri sunuyoruz. Ön-EMT endokardiyal hücreleri ile veya miyokard olmadan kültür olabilir. Post-EMT AV yastık mezenkimal hücreler içinde mekanik kısıtlı ya da stressiz kollajen jeller yetiştirilebilir. Bu 3D in vitro modellerinde anahtar kapak morfojenik olayları taklit ve erken ve geç dönem valvulogenesis mekanizmaları yapısızlaştırdıklarını için yararlıdır.
Protocol
Discussion
Sahne HH14 endokardiyal hücreler izole yöntemi – Runyan ve Markwald tarafından geliştirilen kalpleri başlatmak ve embriyonik EMT 2 modüle faktörleri incelemek için in vitro ortamda, kontrollü bir sağlar. HH14 – miyokardın olmadan kültür endokardiyal eksplantlar biyomekanik veya biyokimyasal müdahalesi olmadan EMT uğramaz. Miyokardın eksplant bırakılırsa endokardiyal hücrelerinin bir alt kümesi mezenkimal dönüşüme işaret edecektir, ancak dış faktörler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mitral 07CVD04: Bu araştırma, Amerikan Kalp Derneği (Scientist Kalkınma Hibe # 0830384N) ve Vakıf Leducq Hartwell Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | ||
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | ||
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific | 2041S | ||
| 4-well culture plates | Nunc | 176740 | ||
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalgene | 566-0020 | ||
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR International | 25384-342 | ||
| Laboratory tape | VWR International | 89097-920 | ||
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | ||
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | ||
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | ||
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | ||
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | ||
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | |||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. 발생학. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. 발생학. 302, 256-256 (2007).
