인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이
Summary
셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 조혈 progenitors은 세미 솔리드 매체 식민지를 형성하는에서 시험 관내 분석이다. 콜로니 형태, 세포 형태학 및 유동세포계측법의 조합은 다른 조혈 lineages 따라 분아 따위에 의해 번식하고 차별 progenitors의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.
Abstract
인간 조혈 줄기 / 전구 세포는 보통 골수, 코드 혈액, 또는 주변 혈액에서 얻은 있으며, 조혈 및 leukemogenesis을 연구하는 데 사용됩니다. 그들은 림프 및 골수양 lineages로 차별화하는 능력이 있습니다. 셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 semisolid 매체 식민지를 형성하는 능력에 의해 증식 및 조혈 progenitors의 차별 패턴을 연구하는 데 사용됩니다. 입력 세포의 고정 숫자에 의해 형성된 콜로니의 숫자와 형태 차별 progenitors의 능력에 대한 사전 정보를 제공하고 세포 분열 따위에 의해 번식. 전지는 더욱 자신의 번호와 유동세포계측법 및 Giemsa 묻은 슬라이드 morphologic 평가를 사용하여 차별 상태를 평가하기 위해 각각의 식민지에서 또는 전체 접시에서 수확 수 있습니다. 이 분석은 골수양하지만 림프하지 차별을 평가하는 데 유용합니다. 이 맥락에서 용어 골수양는 granulocytic, monocytic erythroid 및 megakaryocytic lineages을 포괄하기 위해 넓은 의미에서 사용됩니다.
우리는 주변 혈액에서 파생 기본 인간의 CD34 + 세포의 분화에 oncogenes의 효과를 평가하기 위해이 분석을 사용했습니다. 이러한 목적 세포에 대한이 사건 NUP98 – HOXA9에서, 제어 retroviral 구조 또는 관심의 oncogene을 표현하는 구성 하나와 transduced 있습니다. 우리는 관심과 GFP 표지의 유전자를 생산하는 bicistronic mRNA를 표현 일반적으로 사용되는 retroviral 벡터, MSCV – IRES – GFP를 사용합니다. 세포 retroviral 전달하기 전에 이틀 동안 크린 시토킨의 면전에서 성장하여 미리 활성화됩니다. 또 이틀 뒤에는, GFP + 세포는 형광 활성화된 셀 정렬 (외과)에 의해 격리되며 크린 시토킨로 보충하고 식민지는 일반적으로 표면을 14 일에 나타날 때까지 incubated 메틸 셀룰로오스 함유 semisolid 매체와 혼합. 식민지의 개수와 형태가 설명되어 있습니다. 세포는 다음 접시에서 제거 씻어, 계산 및 유동세포계측법 및 morphologic 심사를 받게됩니다. 조혈 동안 표현 세포 표면 마커 특정 항체와 유동세포계측법는 가계와 성숙 단계에 대한 정보를 제공합니다. 라이트 – Giemsa의 얼룩 후 현미경으로 각각의 세포의 형태학의 연구는 혈통과 성숙에 관한 자세한 정보를 제공합니다. 세포의 비교 oncogene 조혈 차별에 oncogene의 효과를 밝혀와 transduced들에게 빈 벡터 제어와 transduced.
Protocol
Discussion
CFC의 분석은 조혈 progenitors의 확산과 차별의 패턴을 결정하고 oncogenes의 효과를 (4, 5) 연구에 광범위하게 사용되고 있습니다. 그것은 식민지가 단일 조상의 자손을 나타내는 개별적으로 추가 분석을 위해 제거할 수 있습니다 그러한 clonal 분석,되는 액체 문화 이상의 장점이 있습니다. 이러한 전지는 사용 감지 장기적인 문화 시작 셀 (LTC – IC) 분석 (6, 7). CFC 분석의 한계는 더 어려서 progenitors 또는 조…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | ||
| FBS | StemCell Technologies | 06150 | ||
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | ||
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | ||
| FLT-3 ligand | Peprotech | 300-19 | ||
| GM-CSF | Peprotech | 300-03 | ||
| SCF | Peprotech | 300-07 | ||
| TPO | Peprotech | 300-18 | ||
| IL3 | Peprotech | 200-03 | ||
| IL6 | Peprotech | 200-06 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma- Aldrich | A7030 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | ||
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | ||
| HBSS | Life Technologies | 14175 | ||
| PBS | Life Technologies | 14200 | ||
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | ||
| Methocult GF+ H4435 | StemCell Technologies | 04445 | ||
| Human Methylcellulose Enriched Media | R & D Systems | HSC005 | ||
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | ||
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | ||
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | ||
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310 | ||
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | ||
| Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | ||
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | ||
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | ||
| 30 mm non-treated dish | StemCell Technologies | 27150 | ||
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | ||
| Gridded scoring dishes | StemCell Technologies | 27500 | ||
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | ||
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | ||
| Syringes 3 ml | StemCell Technologies | 28240 | ||
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | StemCell Technologies | 28110 | ||
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | ||
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | ||
| TPX sample chambers | Thermo Scientific | A78710018 | ||
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| Shandon filter cards | Thermo Scientific | 5991022 | ||
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Scientific | 59920063 | ||
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Scientific | 100 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | ||
| 1 μm filter paper | VWR | 28307-134 | ||
| Inverted microscope | Nikon | Diaphot | ||
| Microscope camera | Nikon | DS-F11 | ||
| Microscope | Olympus | BX51 | ||
| Microscope camera | Olympus | DP71 | ||
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | ||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | ||
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | ||
| Cytospin | Shandon | Cytospin 2 | ||
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | ||
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
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- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
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- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
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- Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).
