ヒト造血細胞のためのコロニー形成細胞（CFC）アッセイ
Summary
細胞（CFC）アッセイをコロニー形成は、造血前駆細胞が半固形培地でコロニーを形成しているのin vitroアッセイである。コロニー形態、細胞形態、およびフローサイトメトリーの組み合わせは、異なる造血系統に沿って増殖し、分化する前駆細胞の能力を評価するために使用されます。
Abstract
ヒト造血幹細胞/前駆細胞は、通常、骨髄、臍帯血、または末梢血から得られ、造血及び白血病を研究するために使用されています。彼らは、リンパ球と骨髄系の系統に分化する能力を持っている。コロニー形成細胞（CFC）アッセイは、半固形培地でコロニーを形成する能力によって造血前駆細胞の増殖と分化のパターンを研究するために使用されます。入力セルの固定の数によって形成されたコロニーの数と形態は差別化する前駆細胞の能力についての予備的な情報を提供して増殖する。細胞はフローサイトメトリーとギムザ染色スライドの形態学的評価を使用して、その数字と分化の状態を評価するために、個々のコロニーからまたはプレート全体から収穫することができる。このアッセイでは、骨髄がリンパではない差別化を評価するのに便利です。この文脈における用語骨髄性は、単球、顆粒球、赤血球を包含する、その広い意味で使用され、巨核球系統れている。
我々は、末梢血由来の初代ヒトCD34 +細胞の分化に癌遺伝子の効果を評価するために、このアッセイを使用している。この目的のために細胞を対照レトロウイルス構築物またはこの場合NUP98 – HOXA9で、関心の癌遺伝子の発現コンストラクトのどちらかで形質導入されています。我々は、関心とGFPマーカーの遺伝子を生成するバイシストロンmRNAを発現し、一般的に使用されるレトロウイルスベクター、MSCV – IRES – GFPを、採用しています。細胞は、レトロウイルス形質導入の前に二日間のサイトカインの存在下で増殖させることによって事前にアクティブ化されます。さらに2日後に、GFP +細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって単離され、コロニーは表面に現れるまでの14日間一般的に、サイトカインを添加したとインキュベートメチルセルロースを含む半固形培地と混合。コロニーの数と形態は文書化されています。次いで、細胞をプレートから除去し洗浄し、カウント、およびフローサイトメトリーおよび形態学的検査に供される。造血過程で発現する細胞表面マーカーに特異的な抗体とフローサイトメトリーでは、系統と成熟段階についての情報を提供します。ライト – ギムザ染色後、顕微鏡下で個々の細胞の形態学的研究は、系統と成熟に関してさらなる情報を提供しています。癌遺伝子で形質ものに制御空のベクターで形質導入された細胞の比較では、造血系への分化に対する癌遺伝子の影響を明らかにする。
Protocol
Discussion
CFCアッセイは、造血前駆細胞の増殖と分化のパターンを決定し、癌遺伝子（4,5）の効果を研究するために広く使用されています。それは、コロニーは単一の前駆細胞の子孫を代表し、個別に、さらなる分析のために削除できるように、クローン検定というの液体培地より優れています。 CFCアッセイの制限は、より未熟な前駆細胞や造血幹細胞の検出のための適切ではないことがあるので、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | ||
| FBS | StemCell Technologies | 06150 | ||
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | ||
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | ||
| FLT-3 ligand | Peprotech | 300-19 | ||
| GM-CSF | Peprotech | 300-03 | ||
| SCF | Peprotech | 300-07 | ||
| TPO | Peprotech | 300-18 | ||
| IL3 | Peprotech | 200-03 | ||
| IL6 | Peprotech | 200-06 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma- Aldrich | A7030 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | ||
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | ||
| HBSS | Life Technologies | 14175 | ||
| PBS | Life Technologies | 14200 | ||
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | ||
| Methocult GF+ H4435 | StemCell Technologies | 04445 | ||
| Human Methylcellulose Enriched Media | R & D Systems | HSC005 | ||
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | ||
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | ||
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | ||
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310 | ||
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | ||
| Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | ||
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | ||
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | ||
| Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | ||
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | ||
| 30 mm non-treated dish | StemCell Technologies | 27150 | ||
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | ||
| Gridded scoring dishes | StemCell Technologies | 27500 | ||
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | ||
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | ||
| Syringes 3 ml | StemCell Technologies | 28240 | ||
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | StemCell Technologies | 28110 | ||
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | ||
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | ||
| TPX sample chambers | Thermo Scientific | A78710018 | ||
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| Shandon filter cards | Thermo Scientific | 5991022 | ||
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Scientific | 59920063 | ||
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Scientific | 100 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | ||
| 1 μm filter paper | VWR | 28307-134 | ||
| Inverted microscope | Nikon | Diaphot | ||
| Microscope camera | Nikon | DS-F11 | ||
| Microscope | Olympus | BX51 | ||
| Microscope camera | Olympus | DP71 | ||
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | ||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | ||
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | ||
| Cytospin | Shandon | Cytospin 2 | ||
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | ||
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
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