Summary

יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם

Published: December 18, 2010
doi:

Summary

המושבה להרכיב (CFC) assay התא assay במבחנה שבה אבות hematopoietic טופס מושבות בינוני חצי מוצק. שילוב של מורפולוגיה המושבה, מורפולוגיה התא cytometry זרימה משמשים כדי להעריך את היכולת של אבות להתרבות להבדיל לאורך שושלות hematopoietic שונים.

Abstract

האדם hematopoietic גזע / ובתאים מתקבלים בדרך כלל ממח העצם, דם טבורי, או דם היקפיים משמשים ללמוד hematopoiesis ו leukemogenesis. יש להם את היכולת להתמיין שושלות הלימפה ואת מיאלואידית. המושבה להרכיב (CFC) assay תא משמש כדי ללמוד את התרבות ואת דפוס הבידול של אבות hematopoietic על ידי היכולת שלהם ליצור מושבות בתווך מוצק למחצה. המספר את המורפולוגיה של המושבות הוקמה על ידי מספר קבוע של תאים קלט לספק מידע ראשוני על היכולת של אבות להבדיל מתרבים. תאים ניתן לקצור ממושבות הפרט או מהצלחת כולו להמשיך להעריך את מספרם ומדינות בידול באמצעות זרימת cytometry והערכה מורפולוגיים של Giemsa מוכתם שקופיות. Assay זה שימושי להערכת בידול מיאלואידית אך לא הלימפה. מיאלואידית המונח בהקשר זה משמש במובן הרחב שלה כדי להקיף שושלות granulocytic, monocytic, erythroid ו megakaryocytic.

השתמשנו זה assay כדי להעריך את ההשפעות של אונקוגנים על התמיינות של תאים אנושיים העיקרי CD34 + שמקורם דם היקפי. בשביל זה התאים למטרה הם transduced עם לבנות או לשלוט retroviral או לבנות ביטוי oncogene של עניין, במקרה זה NUP98-HOXA9. אנו מעסיקים וקטור retroviral נפוץ, MSCV-IRES-GFP, אשר מבטאת mRNA bicistronic שמייצר הגן של עניין סמן ה-GFP. תאים מופעלות מראש על ידי גידול בנוכחות ציטוקינים יומיים לפני התמרה retroviral. אחרי עוד יומיים, GFP + תאים מבודדים ידי מיון הקרינה המופעל תאים (FACS) ומעורבבים עם המדיום methylcellulose המכילים מוצק למחצה בתוספת ציטוקינים מודגרות עד מושבות להופיע על פני השטח, בדרך כלל על 14 ימים. מספר ומורפולוגיה של המושבות מתועדים. תאים יוסרו אז מן הלוחות, שטף, נספר, והוא נתון cytometry זרימה ובדיקה מורפולוגיים. Cytometry זרימה עם נוגדנים ספציפיים על פני התא סמנים הביע במהלך hematopoiesis מספק מידע על השושלת שלב ההבשלה. מחקרים מורפולוגי של תאים בודדים תחת מיקרוסקופ לאחר מכתים רייט Giemsa לספק מידע נוסף לגבי השושלת והתבגרות. השוואה בין תאים transduced עם בקרת וקטור ריק לאלה transduced עם oncogene מגלה את ההשפעות של oncogene על בידול hematopoietic.

Protocol

1. הכנה של ריאגנטים הכן סטרילי פתרונות מניות 1000x של קינאז FMS הקשורות טירוזין 3 (FLT-3), ליגנד granulocyte / macrophage המושבה גורם מגרה (GM-CSF), תא גזע גורם (SCF), thrombopoietin (TPO), אינטרלוקין (IL) -3 , ו – IL-6 בהתאם להוראות היצרן. הכן Retronectin סטרילי מניו?…

Discussion

Assay CFC נמצא בשימוש נרחב על מנת לקבוע את תפוצת ואת דפוסי הבידול של אבות hematopoietic כדי לחקור את ההשפעות של אונקוגנים (4, 5). יש לו יתרון על פני תרבויות נוזלי להיות assay משובטים, כך המושבות לייצג את הצאצאים של אב יחיד ניתן להסיר באופן פרטני לצורך ניתוח נוסף. המגבלה של assay CFC היא שז?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ג'אלווין Siteman במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה של בארנס יהודים החולים בסנט לואיס, מיזורי, לשימוש של Core סדרן Cell מהירות גבוהה, שסיפקה cytometry זרימת ציוד ושירותים מיון. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01 HL082549 ו K02 HL084179 (NRY). סרטן Siteman מרכז נתמך בחלקו על ידי תמיכה במרכז לחקר הסרטן NCI גרנט P30 CA91842.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
IMDM   Life Technologies 12440  
FBS   StemCell Technologies 06150  
L-Glutamine   Life Technologies 25030  
Penicillin/Streptomycin (PS)   Life Technologies 15140  
FLT-3 ligand   Peprotech 300-19  
GM-CSF   Peprotech 300-03  
SCF   Peprotech 300-07  
TPO   Peprotech 300-18  
IL3   Peprotech 200-03  
IL6   Peprotech 200-06  
Bovine Serum Albumin   Sigma- Aldrich A7030  
EDTA   Fisher Scientific BP118  
Retronectin   Takara Bio Inc T100A  
HBSS   Life Technologies 14175  
PBS   Life Technologies 14200  
Trypan Blue solution (0.4%)   Sigma-Aldrich T8154  
Methocult GF+ H4435   StemCell Technologies 04445  
Human Methylcellulose Enriched Media   R & D Systems HSC005  
Wright/ Giemsa stain   Harleco 64571  
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula   Ricca Chemical Company 1450  
Methanol   Fisher Scientific A412-4  
Cytoseal 60   Thermo Scientific 8310  
Normal Mouse Serum   Rockland Immunochemicals D208  
Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555388  
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551378  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555537  
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551336  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
24-well non-treated tissue culture plates   BD Biosciences 35-1147  
30 mm non-treated dish   StemCell Technologies 27150  
100 mm tissue culture dish   Fisher Scientific 08-757-12  
Gridded scoring dishes   StemCell Technologies 27500  
15 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2097  
50 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2070  
Syringes 3 ml   StemCell Technologies 28240  
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle   StemCell Technologies 28110  
50 μm CellTrics cell filter   Partec 04-004-2327  
Hemocytometer   Fisher Scientific 0267110  
TPX sample chambers   Thermo Scientific A78710018  
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned   Fisher Scientific 12-550-15  
Shandon filter cards   Thermo Scientific 5991022  
Shandon cytospin slide holder   Thermo Scientific 59920063  
Shandon Complete Staining Assembly 100   Thermo Scientific 100  
Kimwipes   Kimberly-Clark Corporation 34155  
1 μm filter paper   VWR 28307-134  
Inverted microscope   Nikon Diaphot  
Microscope camera   Nikon DS-F11  
Microscope   Olympus BX51  
Microscope camera   Olympus DP71  
Scanner   Microtek Scanmaker 4  
Vortex mixer   Fisher Scientific 12-812  
Tissue culture incubator   Sanyo MCO-18AIC  
Cytospin   Shandon Cytospin 2  
Bench-top centrifuge   Eppendorf 5810-R  
Water purification system   Barnstead Nanopure-Diamond  

References

  1. Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
  2. Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
  3. Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
  4. Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
  5. Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
  6. Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
  7. Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).

Play Video

Cite This Article
Sarma, N. J., Takeda, A., Yaseen, N. R. Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells. J. Vis. Exp. (46), e2195, doi:10.3791/2195 (2010).

View Video