Summary

Formanti colonia cellulare (CFC) Analisi per cellule emopoietiche

Published: December 18, 2010
doi:

Summary

La colonia di cellule che formano (CFC) test è un test in vitro in cui progenitori emopoietici formare colonie in terreno semisolido. Una combinazione di morfologia delle colonie, la morfologia delle cellule, e citometria a flusso sono utilizzati per valutare la capacità dei progenitori di proliferare e differenziarsi lungo le varie linee ematopoietiche.

Abstract

Umane ematopoietiche staminali / progenitrici sono solitamente ottenute da midollo osseo, sangue del cordone ombelicale, o dal sangue periferico e sono utilizzati per lo studio ematopoiesi e leucemogenesi. Hanno la capacità di differenziarsi in linee linfoidi e mieloidi. La colonia di cellule che formano (CFC) test è usato per studiare la proliferazione e la differenziazione modello di progenitori emopoietici con la loro capacità di formare colonie in un mezzo semisolido. Il numero e la morfologia delle colonie formate da un numero fisso di celle di input fornire informazioni preliminari circa la capacità dei progenitori di differenziarsi e proliferare. Le cellule possono essere raccolte da singole colonie o da tutta la piastra per valutare ulteriormente il loro numero e gli stati di differenziazione in citometria a flusso e la valutazione morfologica di Giemsa vetrini colorati. Questo test è utile per valutare la differenziazione mieloide, ma non linfoidi. Il mieloide termine in questo contesto è usato nel suo senso più ampio fino a comprendere lignaggi granulocitica, monociti, eritroide e megacariociti.

Abbiamo usato questo test per valutare gli effetti di oncogeni sulla differenziazione delle primarie umane cellule CD34 + derivate dal sangue periferico. Per questo scopo sono le cellule trasdotte con entrambi costruire controllo retrovirali o un costrutto che esprime l'oncogene di interesse, in questo caso NUP98-HOXA9. Ci avvaliamo di un vettore retrovirale comunemente usato, MSCV-IRES-GFP, che esprime un mRNA bicistronic che produce il gene di interesse e di un marcatore GFP. Le cellule sono pre-attivate crescendo in presenza di citochine per due giorni prima della trasduzione retrovirale. Dopo altri due giorni, le cellule GFP + sono isolate dalla fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) e mescolato con un metilcellulosa mezzo contenente semisolido integrato con citochine e incubate fino colonie appaiono sulla superficie, in genere 14 giorni. Il numero e la morfologia delle colonie sono documentati. Le cellule vengono poi rimossi dalle piastre, lavato, contati, e sottoposti a citometria a flusso e l'esame morfologico. Citometria a flusso con anticorpi specifici marcatori di superficie della cellula espressi durante emopoiesi fornisce informazioni sulla genealogia e lo stadio di maturazione. Studi morfologici delle singole cellule al microscopio dopo la colorazione di Wright-Giemsa fornire ulteriori informazioni in materia di genealogia e di maturazione. Confronto di cellule trasdotte con controllo vettoriale vuoto a quelli trasdotte con un oncogene rivela gli effetti del oncogene sulla differenziazione ematopoietiche.

Protocol

1. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Preparare sterili soluzioni stock 1000x di Fms legati tirosin-chinasi 3 (FLT-3) ligando, granulociti / macrofagi colony-stimulating factor (GM-CSF), fattore della cellula staminale (SCF), trombopoietina (TPO), interleuchina (IL) -3 e IL-6 in base alle istruzioni del produttore. Preparare sterile soluzione madre Retronectin (1mg/ml) anche in base alle istruzioni del produttore. Dividere queste soluzioni madri in piccole aliquote e conservare a -20 ° C per evitare il ripetersi di c…

Discussion

Il dosaggio CFC è stato ampiamente utilizzato per determinare la proliferazione e la differenziazione dei modelli di progenitori emopoietici e per studiare gli effetti di oncogeni (4, 5). Ha il vantaggio rispetto a colture liquide di essere un saggio clonale, tanto che le colonie rappresentano la progenie di un solo progenitore e può essere rimossa singolarmente per ulteriori analisi. La limitazione del dosaggio CFC è che non è adeguata per la rilevazione dei progenitori più immaturi o cellule staminali ematopoieti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Alvin J. Siteman Cancer Center della Washington University School of Medicine e Barnes-Jewish Hospital di St. Louis, MO, per l'utilizzo del core ad alta velocità cell sorter, che ha fornito apparecchiature citometria a flusso e servizi di smistamento. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Borse Salute R01 HL082549 e K02 HL084179 (NRY). Il Siteman Cancer Center è sostenuto in parte da un supporto NCI Cancer Center di Grant P30 CA91842.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
IMDM   Life Technologies 12440  
FBS   StemCell Technologies 06150  
L-Glutamine   Life Technologies 25030  
Penicillin/Streptomycin (PS)   Life Technologies 15140  
FLT-3 ligand   Peprotech 300-19  
GM-CSF   Peprotech 300-03  
SCF   Peprotech 300-07  
TPO   Peprotech 300-18  
IL3   Peprotech 200-03  
IL6   Peprotech 200-06  
Bovine Serum Albumin   Sigma- Aldrich A7030  
EDTA   Fisher Scientific BP118  
Retronectin   Takara Bio Inc T100A  
HBSS   Life Technologies 14175  
PBS   Life Technologies 14200  
Trypan Blue solution (0.4%)   Sigma-Aldrich T8154  
Methocult GF+ H4435   StemCell Technologies 04445  
Human Methylcellulose Enriched Media   R & D Systems HSC005  
Wright/ Giemsa stain   Harleco 64571  
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 – Giordano formula   Ricca Chemical Company 1450  
Methanol   Fisher Scientific A412-4  
Cytoseal 60   Thermo Scientific 8310  
Normal Mouse Serum   Rockland Immunochemicals D208  
Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555388  
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551378  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated   BD Biosciences 555537  
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated   BD Biosciences 551336  
Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated   BD Biosciences 557748  
24-well non-treated tissue culture plates   BD Biosciences 35-1147  
30 mm non-treated dish   StemCell Technologies 27150  
100 mm tissue culture dish   Fisher Scientific 08-757-12  
Gridded scoring dishes   StemCell Technologies 27500  
15 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2097  
50 ml centrifuge tubes   BD Biosciences 35-2070  
Syringes 3 ml   StemCell Technologies 28240  
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle   StemCell Technologies 28110  
50 μm CellTrics cell filter   Partec 04-004-2327  
Hemocytometer   Fisher Scientific 0267110  
TPX sample chambers   Thermo Scientific A78710018  
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned   Fisher Scientific 12-550-15  
Shandon filter cards   Thermo Scientific 5991022  
Shandon cytospin slide holder   Thermo Scientific 59920063  
Shandon Complete Staining Assembly 100   Thermo Scientific 100  
Kimwipes   Kimberly-Clark Corporation 34155  
1 μm filter paper   VWR 28307-134  
Inverted microscope   Nikon Diaphot  
Microscope camera   Nikon DS-F11  
Microscope   Olympus BX51  
Microscope camera   Olympus DP71  
Scanner   Microtek Scanmaker 4  
Vortex mixer   Fisher Scientific 12-812  
Tissue culture incubator   Sanyo MCO-18AIC  
Cytospin   Shandon Cytospin 2  
Bench-top centrifuge   Eppendorf 5810-R  
Water purification system   Barnstead Nanopure-Diamond  

References

  1. Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
  2. Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , (2010).
  3. Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
  4. Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
  5. Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
  6. Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
  7. Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).

Play Video

Cite This Article
Sarma, N. J., Takeda, A., Yaseen, N. R. Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells. J. Vis. Exp. (46), e2195, doi:10.3791/2195 (2010).

View Video