Ein Cell-to-cell Makromolekulare Transport Assay In Planta Verwendung Biolistic Bombardment
Summary
Makromolekulare Handel zwischen Pflanzenzellen können durch transiente Expression eines Fluoreszenz-markierten Proteins von Interesse und die Analyse ihrer intra-und interzelluläre Verteilung durch konfokale Mikroskopie beurteilt werden.
Abstract
Hier stellen wir ein einfaches und schnelles Protokoll zu erkennen und zu beurteilen, das Ausmaß der Zell-Zell-makromolekularen Transport in planta. In diesem Protokoll wird ein fluoreszenzmarkierten-Protein von Interesse vorübergehend in Pflanzengewebe folgenden biolistischen Auslieferung der kodierenden DNA-Konstrukt zum Ausdruck gebracht. Die intra-und interzelluläre Verteilung der markierte Protein wird dann durch konfokale Mikroskopie analysiert. Wir beschreiben diese Technik im Detail und bietet Schritt-für-Schritt-Protokolle Assay und der Beurteilung von symplastisch Transport von Proteinen in drei Pflanzenarten, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana und N. tabacum (Tabak).
Protocol
Discussion
Der Schlüssel für den Erfolg der symplastisch Transport-Assay ist eine hohe Transformationseffizienz, die Produktion von statistisch signifikant und leicht nachweisbaren Signal-Cluster ermöglicht zu erhalten. Dies kann erreicht werden mit den Blättern von gesunden, robusten Pflanzen geerntet, und die Vorbereitung Goldpartikel durch eine reine und konzentrierte DNA-Präparation beschichtet werden.
Mit den Blättern an der gleichen Wachstumsphase ist auch entscheidend für den Test Zuverl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unsere Arbeit wird durch Zuschüsse von NIH / NIGMS, NSF, USDA / NIFA und BARD zu VC unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | ||
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | ||
| Spermidine | Sigma | S0266-1G | ||
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | ||
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | ||
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | ||
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | ||
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. . Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes. Virology. 344, 169-184 (2006).
- Epel, B. L. Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases. Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).
- Zambryski, P. C., Crawford, K. Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).
- Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. Growth of plants and presercation of seeds. Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Oparka, K. J. Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves. Cell. 97, 743-754 (1999).
- Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11, 309-322 (1999).
- Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices. Development. 126, 1879-1889 (1999).
- Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Roberts, A. G. Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus. Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).
- Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana. Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).
