A célula-célula Assay Transporte Macromoleculares Na Planta Utilizando Bombardeio biobalística
Summary
Tráfico macromolecular entre células vegetais pode ser avaliado por transitoriamente expressar uma proteína fluorescente-tag de interesse e análise de sua distribuição intra-e intercelular por microscopia confocal.
Abstract
Aqui, apresentamos um protocolo simples e rápida para detectar e avaliar a extensão da célula-célula de transporte macromolecular na planta. Neste protocolo, uma proteína fluorescente etiquetado de interesse é transitoriamente expressa no tecido vegetal após a entrega biobalística de seu DNA de codificação de construir. A distribuição intra-e intercelular da proteína com a tag é então analisada por microscopia confocal. Descrevemos esta tecnologia em detalhes, proporcionando passo-a-passo protocolos para análise e avaliar a extensão do transporte de proteínas simplástico em três espécies de plantas, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana e N. tabacum (tabaco).
Protocol
Discussion
A chave para o sucesso do ensaio de transporte simplástico é a obtenção de alta eficiência de transformação, que permite a produção de aglomerados de sinal estatisticamente significativo e facilmente detectável. Isto pode ser conseguido usando as folhas colhidas de plantas saudáveis e robustas, e preparar partículas de ouro revestidas por uma preparação de DNA puro e concentrado.
Usando as folhas na fase de crescimento mesmo também é vital para a confiabilidade do ensai…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nosso trabalho é suportado por concessões do NIH / NIGMS, NSF, USDA / Nifa e BARD para VC.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | ||
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | ||
| Spermidine | Sigma | S0266-1G | ||
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | ||
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | ||
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | ||
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | ||
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
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