Biz ayrı primer hücrelerin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol<em> Drosophil</em> Embriyolar. Yeteneği, biyokimyasal, moleküler ve hücre görüntüleme yöntemleri ile birlikte, etkili RNAi pertürbasyon yürütmek için çeşitli sorular ele alınacak izin<em> Drosophila</em> Birincil hücreler.
Abstract
Burada Drosophila gastrula embriyolar ayrı hazırlanması ve kültür birincil hücreler için bir yöntem açıklanmaktadır. Kısacası, büyük bir miktarı, genç ve sağlıklı bir sinek embriyolar sahnelenen, toplanan sterilize ve sonra bir cam Homojenizatör kullanarak tek bir hücre süspansiyonu içine fiziksel olarak ayrışmış. Kültür plakaları veya kültür ortamı uygun bir yoğunlukta odasına slaytlar kaplama olduktan sonra, bu hücreler daha fazla kendi özel hücre belirteçleri ile tespit edilebilir çeşitli morfolojik farklı hücre tipleri, ayırt edebilirsiniz. Ayrıca, çift zincirli (ds) RNA'lar gen demonte ortaya çıkarmak için bu hücrelerin tedavisi için şartlar mevcut. Drosophila primer hücrelerde Verimli RNAi dsRNA içeren kültür ortamında hücrelerin sadece banyo yapılır. Diğer moleküler, biyokimyasal, hücre görüntüleme analizleri ile birlikte, etkili RNAi pertürbasyon yürütmek için yeteneği, özellikle Drosophila birincil hücreler, farklılaşmış kas ve nöronal hücrelerin ilgili olanlar olarak cevaplandırılmak üzere çeşitli sorular sağlayacaktır.
Protocol
1. Sinek kafesleri hazırlanması Drosophila (Oregon-R ya da herhangi bir genotip gibi yabani tip suşlar), 32-oz böcek bardak gibi uygun kaplarda büyütün. Büyük embriyo toplama kafesleri Transfer yeni eclosed sinekler veya nüfus kafesleri uçmak. ~ 25 bir sıcaklık ile bir odaya kafesleri Taşı ° C ve nem ~ 65% 12 saatlik ışık ve senkron embriyoların toplanmasını kolaylaştırmak için, 12 saat karanlık bir döngüsü. Onlara pekmez plakalar üzerinde ?…
Discussion
Drosophila hücrelerin primer kültürlerinin gelişim model, büyük ölçüde muhtemelen birincil hücre hazırlık sürecinde çeşitli değişkenlere bağlı olarak değişebilir . Her şeyden önce, yumurtlama için kullanılan uçar genç (eski bir hafta içinde) ve sağlıklı (viral ya da bakteriyel enfeksiyon ücretsiz). Bunlar işe yaramaz ve bu embriyoların elde edilen hücrelerin ayırt edemez ve sadece 1-2 gün hayatta olarak gübresiz veya enfekte embriyolar kaçınılmalıdır. İkincisi, homoje…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JB Damon Runyon Kanser Araştırma Vakfı Bursu DRG-1716-1702 tarafından desteklenmiştir. JZ NIH / NIGMS Bursu F32 GM082174-02 tarafından desteklenmiştir. NP Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden bir araştırmacı.