Summary

مستضد محددة في فيفو الفحص باستخدام خلايا القتل المستهدف CFSE إعتبر

Published: November 09, 2010
doi:

Summary

العديد من الإصابات استثارة رد فعل قوي CTL ، ولكن في بعض الأحيان ، وكمية من الخلايا لا ترتبط الاستجابة لمكافحة مسببات المرض<sup> 1</sup>. مقياس واحد للجودة CTL هي قدرتها على قتل تحديدا<sup> 2</sup>. ويمكن استخدام العلامات CFSE من الخلايا المستهدفة للتحقيق في هذه النوعية ردا CTL<em> في الجسم الحي</em<sup> 3،4</sup>.

Abstract

ويمكن استخدام Carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر (CFSE) بسهولة وبسرعة تسمية السكان الخلية التي تهم التحقيق في الجسم الحي. وتقليديا كانت هذه العلامات تستخدم لدراسة انتشار الأسلحة النووية والهجرة. في أسلوب المعروضة هنا ، ونحن تقصير الفترة الزمنية بعد نقل بالتبني للنظر في البقاء على قيد الحياة وقتل الخلايا حاتمة CFSE محددة الهدف المسمى 4-6. يمكن لمستوى معين من قتل استنساخ الخلية CD8 + T تشير إلى نوعية الاستجابة ، وكميتها قد يكون مضللا. محددة CD8 + الخلايا التائية يمكن أن تصبح مع مرور الوقت استنفدت وظيفيا مع انخفاض في الانتاج خلوى وقتل 7،8. أيضا ، قد بعض الخلايا التائية CD8 + لا تقتل الحيوانات المستنسخة فضلا عن غيرهم مع اختلاف الخصائص TCR 9. لفعالية الخلية الحصانة ساطة (CMI) ، يجب تحديد المستضدات التي تنتج ليس فقط أعدادا كافية للاستجابة خلايا تي ، ولكن أيضا قوية وظيفيا خلايا تي الاستجابة. هنا نقيم قتل خلايا محددة في المئة من اثنين من الببتيد محددة استنساخ خلايا تي في BALB / ج الفئران.

Protocol

1. انتزاع محددة الهدف CTLs المستجيب عن طريق التحصين (يوم 0) قبل البدء ، أن يقرر بناء على المستجيب معينة : النظام الهدف. في هذا المثال من الكلاسيكية في مقايسة CTL الحية ، وسوف نستخدم التحصين الببتيد المنقى لانتزاع م?…

Discussion

يمكن تعديل هذا الاختبار للتحقق من قدرة التكاثري من الخلايا ، بما في ذلك التوسع نسيلي ، لأن يقسم بالتساوي CFSE نسبيا بين 10،11 ذرية. ومن الممكن أيضا استخدام العلامات CFSE الهجرة للتحقيق في الخلية 6،12 ، وإن كانت هناك خلية أخرى تتبع الأساليب التي قد تكون أكثر ملائم?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأود أن أشكر بيانكا MOTHE ، Oseroff كارلا ، وDelGuercio ماري فرنسا على عرضه لي أن المقايسات المناعية والتعامل مع الفأرة. ويتم تمويل عمل في مختبر الفاصل GA بواسطة منحة المعاهد الوطنية للصحة 1 – RO1 – AI – 073558 ، GLRCE منح U54 – 1 – AI – 057153 ، وبين الولايات المتحدة وBARD 3829-06.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
1 mm glass beads   Biospec Products 11079110  
70 μm cell strainer   BD Falcon 352350  
96-well plate   Costar 3799  
Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant   Pacific Immunology n/a  
DMSO   Sigma D-5879  
FBS   GIBCO 16000-077  
FC 500 Flow Cytometer   Beckman Coulter n/a  
Kontes glass tissue grinder   Kontes 885300-0015  
Mini Beadbeater   Biospec Products n/a  
Needle   B-D 305175  
Parafilm “M”   Pechiney Plastic Packaging PM992  
Paraformaldehyde   Electron Microscopy Sciences 157-8  
PBS   GIBCO 10010-023  
PharmLyse lysing reagent   BD Biosciences 555899  
RPMI 1640   GIBCO 11875-093  
Syringe   B-D 309602  
Vybrant CFSE Kit   Invitrogen (Molecular Probes) V12883  

References

  1. Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
  2. Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
  3. Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
  4. Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
  5. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  6. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
  7. Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
  8. Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
  9. Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
  10. Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .

Play Video

Cite This Article
Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells. J. Vis. Exp. (45), e2250, doi:10.3791/2250 (2010).

View Video