BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.<em> Xenopus oositleri</em> Mesajcı RNA enjekte edilerek. Yama kelepçe kayıtları sırasında hücre içi bir çözüm perfüzyon sistemi tarafından kontrol edilir.
Abstract
Burada sunulan protokol büyük iletkenlik, voltaj ve Ca 2 + ile aktive olan K + (BK) kanalları aktivasyon çalışma için tasarlanmıştır. Protokol, aynı zamanda, diğer iyon kanalları ve nörotransmitter reseptörlerinin 1 için yapı-işlev ilişkisi çalışma için kullanılan olabilir. BK kanalları farklı dokularda yaygın olarak ifade edilir ve düz kas kasılması düzenlenmesi, iç saç hücrelerinin frekans ayarı ve nörotransmitter sürüm 2-6 düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok önemli fizyolojik fonksiyonları, suçlanmıştır . BK kanalları membran depolarizasyon ve hücre içi Ca 2 + ve Mg 2 + 6-9 tarafından aktive edilir. Bu nedenle, protokol, membran voltaj ve hücre içi bir çözüm kontrol etmek üzere tasarlanmıştır. Bu protokol, BK kanalları mesajcı RNA 2-5 gün inkübasyon 18 ° C 10-13 takip Xenopus laevis oosit (Evre V-VI) enjekte edilir. Tek veya birden fazla BK kanalları içeren Membran yamalar yama klemp teknikleri 10-13, iç-dış yapılandırma ile eksize. Yama intraselüler tarafı, farklı koşullar altında kanal aktivasyon incelenir, böylece kayıt sırasında istenen çözümleri ile perfüze. Özetlemek gerekirse, BK kanalları mRNA oosit zarı kanal proteinleri ifade Xenopus laevis oosit içine enjekte edilir; yama klemp teknikleri, kontrollü gerilim ve hücre içi çözümleri altında kanallar aracılığıyla akıntılar kaydetmek için kullanılır .
Protocol
1. Oosit içine mRNA enjeksiyon Enjekte 0.05 – 50 ng mesajcı RNA Nanoject II Auto-Nanoliter Enjektör (Drummond Bilimsel Şirket, modeli 3-000-204) kullanarak Xenopus laevis oosit (Evre V-VI), in vitro transkripsiyonu da yapılmıştır . Her mRNA için bir düzine oosit enjeksiyon tekrarlayın. Iki kez kullanarak enjekte oosit durulayın ND-96 solüsyonu (96 mM sodyum klorür (NaCl, Bay 58,44 g / mol), 2 mM potasyum klorür (KCl, Bay 74,56 g / mol), 1.8 mM kalsiyum klorür (CaCl …
Discussion
Oosit ifade sistemin endojen kanalları nispeten düşük arka nedeniyle voltaj bağımlı iyon kanallarının elektrofizyolojik karakterizasyonu için idealdir. Ayrıca, geçici bir ifade sistem olduğundan, bu kanalların mutagenez çalışma yerine etkili bir yöntem sağlar. Ancak, oosit ifade sistemi memeli hücrelerinde farklı olduğunu belirtmek gerekir, böylece farklı alt birimden post-translasyonel modifikasyonu ve dernek farklılıklar olabilir. Ayrıca, lipid konsantrasyonu kanalın fonksiyonel özellikler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Sağlık hibe, R01-HL70393 ve R01-NS060706 JCJC için Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Biyomedikal Mühendisliği profesörü Spencer T. Olin Endowment.
Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269, doi:10.3791/2269 (2011).