אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי
Summary
עמותות גנטית לעתים קרובות להישאר בלתי מוסבר ברמה התפקודית. שיטה זו נועדה להעריך את ההשפעה של פנוטיפ הקשורים סמנים גנטיים על ידי ניתוח ביטוי גנים בתאים הטרוזיגוטיים SNPs עיבד. הטכנולוגיה מאפשרת מדידה מדויקת של MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה לכמת ספציפי אלל פריימר המוצרים הרחבה.
Abstract
מספר עמותות גנטי משמעותי עם תכונות מורכבות נפוצה היא עולה בהתמדה. עם זאת, רוב עמותות אלה אינן מובנות ברמה המולקולרית. אחד המנגנונים המתווך את ההשפעה של גרסאות ה-DNA על פנוטיפים הוא ביטוי גנים, אשר הוכח להיות רלוונטי במיוחד עבור תכונות מורכבות 1.
שיטה זו בדיקות בהקשר הסלולר את ההשפעה של רצפי DNA ספציפיים על ביטוי גנים. העיקרון הוא למדוד את השפע היחסי של תמלילי הנובעים שני אללים של הגן, ניתוח תאים הנושאים עותק אחד של רצפי DNA הקשורים במחלה (גרסאות סיכון) 2,3. לכן, תאים המשמשים בשיטה זו צריכים להיפגש genotypic שתי דרישות בסיסיות: הם צריכים להיות הטרוזיגוטיים הן עבור גרסאות הסיכון הדנ"א סמנים DNA, פולימורפיזמים בדרך כלל קידוד, אשר יכול להבחין תמלילי על בסיס מוצא הכרומוזומים שלהם (איור 1). הסיכון DNA וריאנטים וסמנים DNA לא צריך את תדירות האלל אותו אבל את השלב (haplotypic) מערכת היחסים של סמנים גנטיים צריך להיות מובן. חשוב גם לבחור את סוגי תאים המבטאים את הגן של עניין. פרוטוקול זה מתייחס במיוחד כדי ההליך אימצה לחלץ חומצות גרעין מ fibroblasts אבל השיטה היא החלים באופן שווה על סוגי תאים אחרים, כולל תאים ראשוניים.
DNA ו-RNA המחולצים שורות תאים שנבחרו cDNA נוצר. דנ"א cDNA מנותחים עם assay תחל הרחבה, נועד למקד את סמני DNA קידוד 4. Assay הארכת תחל מתבצעת באמצעות (Sequenom) MassARRAY 5 פלטפורמה פי מפרט של היצרן. הארכה מוצרי פריימר מנותחים מכן על ידי לייזר מטריקס בסיוע desorption / שעה יינון של הטיסה ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/MS). מכיוון סמנים שנבחרו הטרוזיגוטיים הם ייצרו שתי פסגות על פרופילים MS. שטח שיא כל פרופורציונלי שפע התמליל ניתן למדוד עם פונקציה של התוכנה Typer MassARRAY כדי ליצור יחס allelic (אלל 1: אלל 2) החישוב. היחס allelic שהתקבלו cDNA הוא מנורמל באמצעות שמדד מ-DNA גנומי, שם היחס allelic צפוי להיות 1:01 לתקן חפצים טכנית. סמנים עם יחס allelic מנורמל שונה משמעותית 1 לציין כי כמות של תמליל שנוצר משני כרומוזומי באותו תא הוא שונה, דבר המצביע על כך גרסאות ה-DNA הקשורים הפנוטיפ יש השפעה על ביטוי גנים. שולטת ניסויית יש להשתמש כדי לאשר את התוצאות.
Protocol
Discussion
שיטה זו מאפשרת הערכה של ההשפעה של מחלות הקשורות גרסאות ה-DNA על ביטוי גנים על ידי השומה ההבדל vivo אלל ספציפי ברמת התמליל. בפרוטוקול זה שפע תמליל יחסי נמדדת MALDI-TOF אבל טכנולוגיות אחרות המאפשר כימות אלל ספציפי, כגון TaqMan 6,7, ניתן להשתמש. המגבלה העיקרית של גישה זו היא הזמינות של סמנים קידוד עיבד. שיטות מבוססת על העיקרון המתואר כאן, אלא ניצול של סוגים שונים של פולימורפיזם, תוארו. Assay haploChip אמצעים אלל ספציפי ביטוי באמצעות סמנים ממוקם בתוך 1 קילו של תחילת תעתיק או אתר בסופו של הגן אשר יהיה נוכח חומר הכרומטין immunoprecipitated מבודד עם נוגדנים ספציפיים RNA פולימראז II 8. לחלופין, intronic SNPs ניתן להשתמש כאשר התבנית הוא heteronuclear RNA 9.
פרוטוקול מסוים המתואר כאן, בשילוב עם assay haploChip, שימש בהצלחה לזהות גן מועמד דיסלקציה (או לקות קריאה). בתחילה מחקר גנטי העמותה זיהו רצף דנ"א הקשורים דיסלקציה אשר פורש שלושה גנים 10. אלל ספציפי assay ביטוי גנים הראו כי בנוכחות של דיסלקציה הקשורים וריאציה גרסאות ה-DNA ביטוי נצפתה רק אחד משלושת הגנים, אך לא את שני 11.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS | Sigma | P-4417-100TAB | ||
| SDS | Biorad | 161-0416 | ||
| NaCl | VWR | 27788.366 | ||
| Tris | Sigma | T1503-1KG | ||
| EDTA | Sigma | E5134-500G | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| Proteinase K | Sigma | P2308-500MG | ||
| Phenol: chloroform | Sigma | 77617 | ||
| Chloroform | VWR | 100777C | ||
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | ||
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | ||
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | ||
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | ||
| Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | ||
| dNTP | Sigma | DNTP100A | ||
| Exonuclease 1 | NEB | M0293S | ||
| Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | ||
| SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | ||
| MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | ||
| MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | ||
| Equipment | ||||
| Chilled microcentrifuge | Eppendorf | |||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | |||
| SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | |||
| SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |
References
- Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).
- Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide. PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).
- Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Allelic variation in human gene expression. Science. 297, 1143-11 (2002).
- Ding, C., Cantor, C. R. A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).
- Gabriel, S., Ziaugra, L. SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform. Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).
- Lo, H. S. Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).
- Liu, X. Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation. Cancer Res. 65, 99-104 (2005).
- Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading. Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).
- Pastinen, T. A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression. Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).
- Francks, C. A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States. Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).
- Paracchini, S. The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration. Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).
