מבנה 3-D של מולקולה מספק הבנה ייחודית של כמה פונקציות מולקולה. השיטה העיקרית לקביעת המבנה ברזולוציה כמעט אטומי הוא רנטגן קריסטלוגרפיה. כאן, אנו להדגים את השיטות הקיימות לקבלת גבישים תלת ממדי של מקרומולקולה נתון זה מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.
Abstract
באמצעות מבנה תלת ממדי של מקרומולקולות ביולוגיות להסיק כיצד הם פועלים היא אחד התחומים החשובים ביותר של הביולוגיה המודרנית. הזמינות של מבנים ברזולוציה אטומית מספק הבנה עמוקה וייחודית של תפקוד החלבון, ומסייע לפענח את אופן פעולתו של התא החי. נכון להיום, 86% חלבון נתוני הבנק (rcsb-PDB) הערכים הם מבנים macromolecular שנקבעו באמצעות קרני רנטגן קריסטלוגרפיה.
כדי לקבל גבישים מתאימים ללימודי קריסטלוגרפיים, מקרומולקולה (למשל חלבון, חומצות גרעין, חלבונים מורכבים או חלבונים מורכבים חומצת גרעין) חייבים להיות מטוהרים הומוגניות, או קרוב ככל האפשר אל ההומוגניות. ההומוגניות של התכשיר הוא גורם מפתח בהשגת גבישים כי diffract ל ברזולוציה גבוהה (Bergfors, 1999; מקפרסון, 1999).
התגבשות דורש להביא את מקרומולקולה כדי רוויה. המדגם ולכן צריך להיות מרוכזים כדי הריכוז הגבוהה ביותר האפשרית מבלי לגרום להצטברות משקעים או של מקרומולקולה (בדרך כלל 2-50 מ"ג / מ"ל). הצגת המדגם לסוכן מזרז יכול לקדם את נוקלאציה של גבישי חלבון בתמיסה, אשר עלולה לגרום תלת ממדי גבישים גדולים גדל מפתרון. ישנן שתי שיטות עיקריות להשיג גבישים: דיפוזיה אדי התגבשות אצווה. ב אדי דיפוזיה, ירידה המכיל תערובת של פתרונות נמהר וחלבון אטום בתא עם נמהר טהור. אדי מים ואז מפזרת את הירידה עד osmolarity הירידה ואת נמהר שווים (איור 1 א). התייבשות גורמת לירידה של ריכוז של חלבון איטי וגם מזרז עד שיווי המשקל מושגת, אידיאלי באזור נוקלאציה קריסטל של הדיאגרמה שלב. השיטה מסתמכת על אצווה להביא את החלבון ישירות לתוך אזור נוקלאציה על ידי ערבוב חלבון עם כמות מתאימה של נמהר (איור 1B). שיטה זו מבוצעת בדרך כלל תחת פרפין / שמן תערובת מינרלים כדי למנוע דיפוזיה של מים מתוך הירידה.
להלן נדגים שני סוגים של התקנה ניסיונית דיפוזיה אדי, תלוי ירידה ושחרר ישיבה, בנוסף התגבשות אצווה תחת שמן.
Protocol
חומרים: מדגם חלבון – ליזוזים (50 מ"ג / מ"ל) תליית 24 גם מגש ירידה ישיבה ירידה של 24 היטב מגש Microbatch התגבשות 96 מגש טוב <li style=";text-align:right;direc…
Representative Results
Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat…
Discussion
במאמר זה אנו מתארים ולהפגין פרוטוקולים הנוכחי כללית התגבשות החלבון. מאז אותו הליך רב שלבי יש כמה שיקולים אחד צריך להיות מודע. כאשר עובדים עם כמויות קטנות מאוד (0.5-2 μL), ייבוש הירידה עקב התאדות הוא החשש העיקרי. לפיכך, מומלץ לעבוד בסביבה מבוקר היטב (עם זרימת אוויר נמוכה, ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרס בורוז החוקר ברוכים הבאים י"מ ועל ידי עמיתי בראון-Coxe דוקטורים מאוניברסיטת ייל MD.