De cristalización de proteínas para la cristalografía de rayos X
Summary
La estructura 3-D de una molécula proporciona un conocimiento único de cómo funciona la molécula. El principal método para la determinación de la estructura en casi atómica resolución cristalografía de rayos X. En este sentido, demostrar los métodos actuales de obtención de cristales tridimensionales de cualquier macromolécula, dado que son adecuados para la determinación de la estructura por cristalografía de rayos X.
Abstract
Usando la estructura tridimensional de macromoléculas biológicas para deducir su funcionamiento es uno de los campos más importantes de la biología moderna. La disponibilidad de las estructuras de resolución atómica proporciona una comprensión profunda y única de la función de proteínas, y ayuda a desentrañar el funcionamiento interno de la célula viva. Hasta la fecha, el 86% de la Protein Data Bank (PDB-RCSB) las entradas son estructuras macromoleculares que se determinaron utilizando cristalografía de rayos X.
Para obtener cristales adecuados para los estudios de cristalografía, la macromolécula (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos y complejos proteína-proteína o proteína-ácido nucleico complejo) debe ser purificado a homogeneidad, o lo más cerca posible a la homogeneidad. La homogeneidad de la preparación es un factor clave en la obtención de cristales que se difractan a alta resolución (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
La cristalización requiere llevar la macromolécula a la sobresaturación. La muestra, por tanto, concentra a la mayor concentración posible, sin causar la agregación o precipitación de la macromolécula (generalmente 20-50 mg / ml). La introducción de la muestra a un agente precipitante no puede promover la nucleación de cristales de proteínas en la solución, lo cual puede resultar en grandes cristales tridimensionales de crecimiento de la solución. Existen dos técnicas principales para obtener cristales: la difusión del vapor y la cristalización por lotes. En la difusión del vapor, una gota que contiene una mezcla de soluciones de precipitación y de la proteína se encuentra sellado en una cámara con precipitación puro. El vapor de agua se difunde fuera de la gota hasta que la osmolaridad de la gota y la precipitación son iguales (fig. 1A). La deshidratación de la caída provoca una lenta concentración de proteínas y precipitación hasta que se alcanza el equilibrio, a ser posible en la zona de la nucleación de cristales del diagrama de fase. El método se basa en lotes con lo que el de proteínas directamente en la zona de la nucleación de la proteína se mezcla con la cantidad apropiada de precipitación (fig. 1B). Este método se realiza generalmente bajo una parafina / mezcla de aceite mineral para evitar la difusión de agua de la gota.
Aquí se muestran dos tipos de montaje experimental para la difusión del vapor, colgando caer y caer sentado, además de la cristalización por lotes en el aceite.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo se describen y demuestran en general los protocolos actuales para la cristalización de proteínas. Ya que un procedimiento de múltiples pasos que hay algunas consideraciones hay que tener en cuenta. Cuando se trabaja con volúmenes muy pequeños (0.5-2 l), el secado de la caída debido a la evaporación es una preocupación importante. Por lo tanto, se recomienda trabajar en un entorno bien controlado (con flujo de aire de baja, alta humedad y control de la temperatura ajustada) y la adopción de una…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por un Premio al Investigador Burroughs Wellcome para YM y por una beca postdoctoral de Brown-Coxe de la Universidad de Yale a MD.
Materials
| New Item | ||||
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | ||
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | ||
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | ||
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | ||
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | ||
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | ||
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | ||
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
References
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