X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화
Summary
분자의 3 차원 구조는 어떻게 분자 기능의 독특한 이해를 제공합니다. 가까운 원자 해상도 구조 결정을위한 주요 방법은 X – 레이 crystallography입니다. 여기서는 X – 레이 crystallography에 의해 구조 결정에 적합 특정 macromolecule의 세 차원 결정을 얻기위한 현재의 방법을 보여줍니다.
Abstract
그들이 작동하는 방법 추론하기 위해 생물 학적 macromolecules의 3 차원 구조를 사용하는 것은 현대 생물학의 가장 중요한 분야 중 하나입니다. 원자 해상도 구조의 가용성 단백질 기능의 깊이와 독특한 이해를 제공하고, 살아있는 세포의 내부 동작을 해명하는 데 도움이됩니다. 날짜하려면, 단백질 데이터 은행 (rcsb – PDB) 항목의 86 %가 X – 레이 crystallography를 사용하여 결정 macromolecular 구조입니다.
crystallographic 연구에 적합한 결정을 얻으려면,이 macromolecule (예 : 단백질, 핵산, 단백질 – 단백질 복합 단백질이나 핵산 복합) 균질성을 정화해야하며, 가까이 가능한 균등 수 있습니다. 준비의 균질성는 (; 맥퍼슨 1999 Bergfors, 1999) 높은 해상도로 분해하다 결정을 얻기에있는 중요한 요인이다.
결정은 과포화에 macromolecule을 가져 필요합니다. 샘플 따라서 집합 또는 macromolecule (보통 20-50 MG / ML)의 강수량을 유발하지 않고 가능한 가장 높은 농도로 집중해야합니다. precipitating 대리인에게 샘플을 소개하는 솔루션에서 성장하는 대형 입체적인 결정이 발생할 수 있습니다 솔루션에 단백질 결정의 핵을 홍보할 수 있습니다. 수증기 확산 및 배치 결정 : 결정을 얻는 두 가지 주요 기술이 있습니다. 수증기 확산, 침전제 및 단백질 솔루션의 혼합물을 포함하는 드롭 순수한 침전제있는 챔버에 봉인합니다. 드롭과 침전제의 osmolarity가 (그림 1A) 동일 때까지 수증기 그 다음 드롭 아웃 diffuses. 평형이 달성 때까지 드롭의 탈수는 이상적인 위상 다이어그램의 결정 핵의 영역에, 단백질과 침전제 모두 느린 농도가 발생합니다. 배치 방법은 침전제의 해당 금액을 (그림 1B)와 혼합 단백질에 의해 직접 핵 영역에 단백질을 가져에 의존합니다. 이 방법은 일반적으로 드롭 밖으로 물의 확산을 방지하기 위해 파라핀 / 미네랄 오일 혼합에 따라 수행됩니다.
우리가 기름을 아래에 배치 결정 이외에 드롭하고 앉아 드롭 매달려, 증기 확산을위한 실험 설정의 두 종류를 보여줄 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서 우리는 단백질 결정화에 대한 일반적인 현재의 프로토콜을 설명하고 보여줍니다. 그 다단계 절차부터 몇 가지 고려 사항에 대해 알고 있어야 한 필요가있다. 증발로 인해 드롭의 건조 아주 작은 볼륨 (0.5-2 μL)과 함께 작업할 때하는 것은 중요한 관심사입니다. 따라서 그것은 잘 통제된 환경에서 작동하는 (낮은 공기 흐름, 높은 습도와 꽉 온도 제어)와 야외에있는 드롭의 노출을 최소?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 YM에 버로우즈 웰컴의 인베스티게이터 수상과 MD로 예일 대학에서 브라운 – 콕스 박사 과정 이수 원정대에 의해 지원되었다.
Materials
| New Item | ||||
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | ||
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | ||
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | ||
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | ||
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | ||
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | ||
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | ||
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
References
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