تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس
Summary
نقدم بروتوكول لانتاج المستضد محددة الماوس T – تنبيغ الخلايا باستخدام فيروسات
Abstract
مستقبلات الخلية T – (TCRs) تلعب دورا مركزيا في النظام المناعي. يمكن TCRs على سطوح الخلايا T – تعترف تحديدا مستضدات الببتيد التي قدمها مستضد تقديم الخلايا (ناقلات الجنود المدرعة) 1. هذا الاعتراف يؤدي الى تنشيط خلايا تي وسلسلة من النتائج الفنية (مثل إنتاج السيتوكينات ، وقتل الخلايا المستهدفة). فهم دور وظيفي للTCRs أمر بالغ الأهمية لتسخير قوة جهاز المناعة لعلاج العديد من الأمراض المتصلة المناعة (سرطان على سبيل المثال أو المناعة الذاتية).
أنه لأمر مريح للدراسة في نماذج TCRs الماوس ، والذي يمكن أن يتحقق بعدة طرق. صنع نماذج الماوس المعدلة وراثيا TCR مكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، وحاليا لا يوجد سوى عدد محدود منهم المتاحة 2-4. بدلا من ذلك ، يمكن أن تتولد الفئران مع مستضد محددة خلايا تي من قبل نخاع العظم وهم. هذا الأسلوب يستغرق عدة أسابيع أيضا ، ويتطلب خبرة 5. تنبيغ من فيروسات TCRs في المختبر في الماوس تنشيط خلايا تي هو وسيلة سريعة وسهلة نسبيا للحصول على خلايا تي من التحديد الببتيد MHC – المرجوة. يمكن أن تتولد مستضد محددة (خلايا تي) في أسبوع واحد وتستخدم في أي تطبيقات المصب. دراسة transduced الخلايا التائية كما التطبيق المباشر لالمناعي البشري ، ونقل بالتبني من الخلايا البشرية transduced – T مع TCRs محددة مستضد هو استراتيجية الناشئة لعلاج السرطان 6.
هنا نقدم بروتوكول لتنبيغ retrovirally TCRs في المختبر الى تنشيط خلايا تي الماوس. ويمكن استخدام كل من جينات الإنسان والفأر TCR. يتم إنشاء الفيروسات القهقرية تحمل جينات محددة TCR واستخدامها لتصيب الماوس تنشيط خلايا تي مع أضداد CD3 ومكافحة CD28. بعد التوسع في المختبر ، ويتم تحليل transduced الخلايا التائية التي التدفق الخلوي.
Protocol
Discussion
عدة خطوات حاسمة من أجل تحقيق أفضل النتائج. يجب أن تبقى بلات – E خط التعبئة والتغليف في الخلية حالة صحية جيدة. إذا لزم الأمر ، يمكن passaged الخلايا بضع مرات في المتوسط مع DMEM 1 ميكروغرام / مل بوروميسين ، ميكروغرام / 10 مل blasticidin لمنع فقدان فيروسات هيكل بروتين تعبير. يوم ترنسفكأيشن ، ينبغي أن تكون الخلايا ~ متموجة 80 ٪. قد خلايا قليلة جدا أو كثيرة جدا تقلل من عيار الفيروس. يمكن التحقق من نوعية الفيروس عن طريق اختبار على خطوط الخلية التي يمكن transduced بسهولة. منذ TCRs يتطلب أعرب CD3 المجمعات على سطح الخلية ، ونحن نستخدم بشكل روتيني 58α-/β- خلايا ورم هجين 10 (خط الخلية التي لا تعبر عن الذاتية أو سلسلة TCR α β ، لكن التعبير عن CD3 المعقدة). نحصل على ما يقرب من 100 ٪ من الكفاءة تنبيغ الخلايا خلايا ورم هجين عندما transducing مع 1 مل من طاف الفيروس. وأخيرا ، فإن الخلايا التائية ضرورة تفعيلها وبسبب تكاثر الفيروس الارتجاعي يمكن أن تصيب فقط تقسيم بنشاط الخلايا.
قدم هنا طريقة لإنتاج محددة مستضد الخلايا التائية عدة قيود. الأول ، أنه من الصعب أن تصل إلى 100 ٪ كفاءة تنبيغ للماوس الأولية (خلايا تي). جزء من خلايا لا تعبر عن TCR المصالح. ثانيا ، transduced TCR α β وسلاسل يمكن mispair TCRs الذاتية مع 9 ، التي قد تقلل من مستوى التعبير TCR المصالح. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتسبب TCRs mispaired المناعة الذاتية في الجسم الحي 11. أخيرا ، ليس هناك سوى فترة زمنية محدودة transduced الخلايا التائية يمكن استخدامها. بعد حوالي أسبوع واحد ، والخضوع لموت الخلايا المبرمج الخلايا ما لم يتم إعادة حفز. ومع ذلك ، قد تصبح استنفاد الخلايا وفقدان الوظائف المتكررة مع إعادة التحفيز.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5U01CA137070) والجمعية الأميركية للسرطان (RSG – 09 – 070 – 01 – LIB) ، وهو معهد أبحاث السرطان محقق جائزة (MK) ، وجمعية القلب الأميركية قبل الدكتوراه زمالة (كم) و وزارة التربية والتعليم الاسبانية والعلوم زمالة (APG).
نود أن نشكر الدكتور نيكولاس Restifo والدكتور Zhiya يو (NIH / NCI) للحصول على اقتراحات مفيدة للبروتوكول.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | ||
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | ||
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | ||
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | ||
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | ||
| Recombinant human IL2 | Peprotech | 200-02 | ||
| Anti-CD3e antibody | BD Bioscience | 553057 | ||
| Anti-CD28 antibody | BD Bioscience | 553294 | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | ||
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | ||
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Bioscience | 356469 | ||
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | ||
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | ||
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | ||
| FBS | Hyclone | SH3008803 | ||
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | ||
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | ||
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | ||
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | ||
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | ||
| β- Mercaphoethanol | Invitrogen | 21985-023 |
Media:
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid).
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep).
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaphoethanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate).
References
- Krogsgaard, M., Davis, M. M. How T cells ‘see’ antigen. Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).
- Berg, L. J. Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand. Cell. 58, 1035-1046 (1989).
- Hogquist, K. A. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Yu, Z. Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance. J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).
- Holst, J. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Morgan, R. A. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 314, 126-129 (2006).
- Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy. Gene Ther. 1, 136-138 (1994).
- Szymczak, A. L. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).
- Letourneur, F., Malissen, B. Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin. Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).
- Bendle, G. M. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy. Nat. Med. 16, 565-570 (2010).
