Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

Summary

Vi presentiamo un metodo per preparare le fette di organotipica metà gestazione embrioni di topo per l'imaging coltivazione e time-lapse di escrescenza dei nervi periferici.

Abstract

Per molti scopi, la coltivazione di embrioni di topo ex vivo come fette organotipica è auspicabile. Per esempio, impieghiamo una linea di topo transgenico (tauGFP) in cui la versione migliorata della proteina verde fluorescente (EGFP) è esclusivamente espressa in tutti i neuroni del sistema di sviluppo nervoso centrale e periferico ^1, ammettendo la possibilità ad entrambi film di innervazione del la zampa anteriore e di manipolare questo processo con tecniche farmacologiche e genetiche ^2. Il parametro più critico di successo nella coltivazione di culture fetta tale è il metodo con cui vengono preparate le fette. Dopo un'ampia sperimentazione di una varietà di metodi, abbiamo scoperto che una vibratome è il dispositivo migliore per affettare gli embrioni in modo tale da risultare in routine di una cultura che dimostra la vitalità in un periodo di diversi giorni e, soprattutto, si sviluppa in un'epoca specifico modo. Per la metà della gestazione gli embrioni, questo include la conseguenza normale di nervi spinali dal midollo spinale e gangli delle radici dorsali ai loro obiettivi in ​​periferia e alla corretta decisione del tessuto scheletrico e muscolare.

In questo lavoro, presentiamo un metodo per l'elaborazione di embrioni intero del giorno embrionale (E) E10 a E12 in 300-400 fette micrometro per la coltivazione in una cultura incubatore standard di tessuto, che può essere studiato per un massimo di due giorni dopo la preparazione fetta. Critico per il successo di questo approccio è l'uso di un vibratome per tagliare ogni agarosio-embedded embrione. Questa è seguita dalla coltivazione delle fette su inserti cultura membrana Millicell posti sopra un piccolo volume di media, risultando in una tecnica cultura interfaccia. Una cucciolata con una media di 7 embrioni produce regolarmente almeno 14 fette (2-3 fette della regione degli arti anteriori per embrione), che varia leggermente a causa dell'età degli embrioni e allo spessore delle fette. Circa l'80% delle fette colta spettacolo escrescenza del nervo, che può essere misurato througout i ² periodo coltura. Risultati rappresentativi utilizzando la linea del mouse tauGFP sono dimostrati.

Protocol

Parte 1: Preparazione per affettare e coltura. Preparare 10 cm piastre di coltura di tessuto con taglio medio (DMEM, 25% 1x HBSS, il 25% di siero fetale bovino, 0,5% di glucosio, 1 mM glutammina, 2,5 HEPES mM, pH 7,3) e di 3 cm Millicell-CM 0.4-micron cultura inserti in membrana e di tenere incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. Riscaldare il 4% agarosio a basso punto di fusione in PBS nel forno a microonde e tenerlo a piastra di riscaldamento in modo che rimanga a circa 37 ° C. Ri…

Discussion

In un confronto di metodi per preparare culture fetta embrionale di metà gestazione embrioni di topo (E10 – E12), abbiamo osservato che una vibratome produce senza dubbio i risultati più attendibili rispetto sia alla viabilità complessiva della culture e la riproducibilità dei il nervo escrescenza modelli. Al contrario, fette preparati con un elicottero dei tessuti McIlwain ³ dimostrato di essere completamente non vitali. Inizialmente abbiamo utilizzato un metodo ghigliottina ^4, in cui un inter…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
HBSS 10x		GIBCO	14180
Dissection tools		FST	various
L.M.P. agarose		Invitrogen	15517-022
Whatmann paper		Whatman Int.	3030917
Shortened firepolished pipettes
DMEM		GIBCO	41966
FBS		GIBCO	10270-106
Pen Strep		GIBCO	15140
L-glutamine 100x		GIBCO	25030
Vibratome		Microm International GmbH	HM 650 V
Fluorescent microscope		Olympus	BX61WI
analySIS		Soft Imaging System
Millicell-CM inserts		Millipore	PICMORG 50
10 cm culture plates		Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406		Henkel	142580
Razor blades		Thermo Fisher	none
Dissecting microscope		Nikon	SMZ800
HEPES		Roth	9105.2
Glucose		Sigma	G7021
x4 objective		Olympus	PL series
x10 objective		Olympus	UPLFL –PH series
Filter		Olympus	U-MNIBA2
CCD camera		Soft Imaging System	SIS F-View II
Equipment for heated chamber		Leica	CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171