الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا
Summary
طريقة موثوقة ذات كفاءة عالية<em> في المختبر</em> التعبير وتسجيل الكهربية لاحقة من المؤتلف قنوات ايون الجهد بوابات في خلايا الكلى البشرية المستزرعة الجنينية (كلوة الجنين البشري – 293T).
Abstract
والتعبير في المختبر وتسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات في خلايا الكلى البشرية المستزرعة الجنينية (كلوة الجنين البشري – 293T) هو استراتيجية للبحث في كل مكان. يجب أن تكون مطلية كلوة الجنين البشري على خلايا – 293T coverslips الزجاج في كثافة منخفضة بما فيه الكفاية بحيث أنها ليست على اتصال مع بعضها البعض من أجل السماح لتسجيل الآثار الكهربية دون التباس بسبب اتصال مع الخلايا المجاورة. ويجب أيضا أن أعرب عن Transfected قنوات ذات كفاءة عالية في غشاء البلازما لخلية كاملة التصحيح تسجيل المشبك التيارات كشف عن مستويات الضوضاء. القنوات الأيونية غيروي غالبا ما تتطلب فترات حضانة طويلة عند 28 درجة مئوية بعد ترنسفكأيشن من أجل تحقيق الكافي التعبير الغشاء ، ولكن هناك زيادة الخسائر في خلية التصاق ساترة والاستقرار في هذا الغشاء درجة الحرارة. للتحايل على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير استراتيجية الأمثل لخلايا كلوة الجنين البشري – 293T transfect واللوحة. هذا الأسلوب يتطلب أن تكون الخلايا في transfected confluency مرتفعة نسبيا ، وحضنت في 28 درجة مئوية لفترات متفاوتة الحضانة بعد ترنسفكأيشن كافية للسماح لقناة أيون بروتين تعبير. ومطلي ثم الخلايا Transfected coverslips على الزجاج والمحتضنة في 37 درجة مئوية لعدة ساعات ، والذي يسمح لمرفق خلية جامدة إلى coverslips وrestabilization الغشاء. يمكن تسجيل الخلايا بعد وقت قصير من الطلاء ، أو يمكن نقلها إلى 28 درجة مئوية لمدة حضانة أخرى. نجد أن الاحتضان الأولي في 28 درجة مئوية ، بعد ترنسفكأيشن لكن قبل الطلاء ، هو المفتاح للتعبير عن كفاءة قنوات ايون غيروي التي عادة لا تعبر جيدا في غشاء البلازما. transfected بشكل إيجابي ، ويتم تحديد الخلايا المستنبتة من خلال التعاون مع وأعرب eGFP أو eGFP أعرب من ناقلات bicistronic (على سبيل المثال ، pIRES2 EGFP) يحتوي على قناة أيون المؤتلف [كدنا] المنبع فقط من دخول موقع الريبوسوم الداخلية وتسلسل eGFP الترميز. خلية كاملة تسجيل المشبك التصحيح يتطلب معدات متخصصة ، بالإضافة إلى صياغة من الأقطاب الكهربائية تسجيل المصقول وأقطاب الأرض على شكل حرف L من الزجاج البورسليكات. لا يمكن أن يتحقق تسليم المخدرات لدراسة الصيدلة من القنوات الأيونية التي micropipetting مباشرة المخدرات في صحن التسجيل ، أو باستخدام نظم تدفق microperfusion أو الجاذبية التي تنتج تيارات غير منقطعة من المخدرات على حل الخلايا المسجلة.
Protocol
Discussion
أن تكون قادرة على تسجيل كامل الخلية التيارات باستخدام البروتوكولات وصفها والحلول يشير إلى أن ترنسفكأيشن كانت ناجحة وأن المطلوب قنوات ايون الجهد أو بوابات المجمعات قناة ايون موجودة بكميات كبيرة في غشاء الخلية. وينبغي transfected الخلايا بشكل إيجابي (أي الفلورية الخضر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال اكتشاف المنحة التشغيل إلى JDS من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث (NSERC) في كندا ، والكسندر غراهام بيل كندا NSERC منح دراسات عليا (دكتوراه) (ألف لSENATORE) ومؤسسة القلب والسكتة الدماغية ، منحة على سبيل المعونة NA # 6284.
Materials
| Material | Company | Catalogue Number | Comment |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 – 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Zeiss Canada | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Microelectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , (2003).
- Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
