Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen
Summary
Betrouwbare methode voor zeer efficiënte<em> In vitro</em> Expressie en de daaropvolgende elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ionkanalen in gekweekte humane embryonale niercellen (HEK-293T).
Abstract
De in vitro expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ionkanalen in gekweekte humane embryonale niercellen (HEK-293T) is een alomtegenwoordige onderzoeksstrategie. HEK-293T cellen moeten worden uitgeplaat op dekglaasjes bij laag genoeg dichtheid, zodat ze niet in contact met elkaar, om voor de elektrofysiologische opname mogelijk te maken zonder verstorende effecten als gevolg van contact met de aangrenzende cellen. Getransfecteerd kanalen moeten ook uitdrukken met een hoog rendement bij het plasmamembraan van whole-cell patch clamp-opname van aantoonbare stromen boven geluidsniveau. Heterologe ion kanalen vereisen vaak lange incubatieperiode bij 28 ° C na transfectie om adequate membraan expressie te bereiken, maar er zijn steeds meer verlies van cel-adhesie dekglaasje en membraan stabiliteit bij deze temperatuur. Om dit probleem te omzeilen, ontwikkelden we een optimale strategie om transfecteren en plaat HEK-293T cellen. Deze methode vereist dat de cellen worden getransfecteerd bij een relatief hoge confluentie, en geïncubeerd bij 28 ° C voor de verschillende incubatie periode post-transfectie zodat er passende ionkanaal eiwit expressie. Getransfecteerde cellen worden daarna uitgeplaat op dekglaasjes en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende enkele uren, die zorgt voor stijve cel gehechtheid aan de dekglaasjes en membraan restabilization. Cellen kunnen worden opgenomen kort na plateren, of kan worden overgedragen aan 28 ° C voor verdere incubatie. We vinden dat de eerste incubatie bij 28 ° C, na transfectie maar voor plating, is de sleutel voor de efficiënte expressie van heterologe ion kanalen die normaal gesproken niet goed te spreken over de plasmamembraan. Positief getransfecteerde, zijn gekweekte cellen geïdentificeerd door co-expressie eGFP of eGFP uiting van een bicistronische vector (bijv. pIRES2-EGFP) die de recombinante ionkanaal cDNA net stroomopwaarts van een interne ribosoom entry site en een eGFP coderende sequentie. Whole-cell patch clamp opname vereist gespecialiseerde apparatuur, plus het vervaardigen van gepolijste registrerende elektroden en L-vormige massa-elektroden van borosilicaatglas. Drug delivery van de farmacologie van ionen kanalen studie kan worden bereikt door direct micropipetting drugs in de opname gerecht, of door gebruik te maken microperfusion of zwaartekracht stroom systemen die een ononderbroken stromen van het geneesmiddel oplossing productie van meer dan opgenomen cellen.
Protocol
Discussion
In staat zijn om whole-cell stromen met behulp van de beschreven protocollen en oplossingen record geeft aan dat de transfectie succesvol was en dat het gewenste voltage-gated ion kanalen of ionkanaal complexen aanwezig zijn met aanzienlijke hoeveelheden op het celmembraan. Indien de cellen die positief worden getransfecteerd (dat wil zeggen fluorescerend groen) maar geen recordable stromingen, extra tijd bij 28 ° C kan nodig zijn om het kanaal eiwit goed worden verpakt en ingevoegd in de celmembraan. Merk op dat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Discovery exploitatiesubsidie aan JDS van het Natural Science and Engineering Research Council (NSERC) van Canada, een NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Beurzen (doctoraal) (naar A. Senatore) en de Hart en Stroke Foundation, Grant -In-Aid NA # 6284.
Materials
| Material | Company | Catalogue Number | Comment |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 – 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Zeiss Canada | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Microelectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , (2003).
- Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
