Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T
Summary
Metodo affidabile per l'alta efficienza<em> In vitro</em> Espressione e la successiva registrazione elettrofisiologica di ricombinante voltaggio-dipendenti canali ionici in colture di cellule renali umane embrionali (HEK-293T).
Abstract
L'espressione in vitro e la registrazione elettrofisiologica di ricombinante voltaggio-dipendenti canali ionici in colture di cellule renali umane embrionali (HEK-293T) è una strategia di ricerca onnipresente. HEK-293T cellule devono essere placcato sulla coverslips vetro a bassa densità sufficiente in modo che non siano in contatto tra loro al fine di consentire la registrazione elettrofisiologica senza effetti confondenti dovuti al contatto con le cellule adiacenti. Canali transfettate deve anche esprimere ad alta efficienza a livello della membrana plasmatica per la cellula intera registrazione patch clamp delle correnti rilevabili di sopra dei livelli di rumore. Canali ionici eterologa spesso richiedono lunghi periodi di incubazione a 28 ° C dopo trasfezione al fine di raggiungere un'adeguata espressione di membrana, ma ci sono sempre perdite di cellule coprioggetto adesione e la stabilità della membrana a questa temperatura. Per aggirare questo problema, abbiamo sviluppato una strategia ottimizzata per trasfezione e piastra HEK-293T cellule. Questo metodo richiede che le cellule sono transfettate in una confluenza relativamente alto, e incubate a 28 ° C per diversi periodi di incubazione post-trasfezione per consentire un'adeguata espressione della proteina del canale ionico. Cellule transfettate vengono placcati su coprioggetto di vetro e incubate a 37 ° C per diverse ore, che permette di attaccamento cellula rigida per i coprioggetti e ristabilizzazione della membrana. Le celle possono essere registrate subito dopo placcatura, o possono essere trasferiti a 28 ° C per l'incubazione ulteriormente. Troviamo che l'incubazione iniziale a 28 ° C, dopo trasfezione ma prima di placcatura, è la chiave per l'espressione efficace dei canali ionici eterologa che normalmente non esprimono bene a livello della membrana plasmatica. Positivamente transfettate, cellule in coltura sono identificati da co-espressi eGFP o eGFP espresso da un vettore bicistronic (ad esempio pIRES2-EGFP) contenente il canale ionico del DNA ricombinante appena a monte di un sito interno ingresso ribosoma e una sequenza eGFP codifica. Whole-cell patch clamp registrazione richiede attrezzature specializzate, oltre alla lavorazione di elettrodi di registrazione e lucido a forma di L elettrodi di massa in vetro borosilicato. Somministrazione di farmaci per studiare la farmacologia dei canali ionici può essere ottenuto direttamente micropipetting droga nel piatto di registrazione, oppure utilizzando microperfusione o sistemi di flusso di gravità che producono flussi ininterrotti di soluzione farmaco sulle cellule registrate.
Protocol
Discussion
Essere in grado di registrare a cellula intera correnti utilizzando i protocolli descritti e soluzioni indica che la trasfezione ha avuto successo e che la tensione desiderata-canali ionici o complessi di canali ionici sono presenti con quantità significative a livello della membrana cellulare. Dovrebbe essere positivamente le cellule transfettate (cioè fluorescente verde) ma non sono le correnti registrabili, tempo supplementare a 28 ° C può essere necessario per consentire la proteina canale che deve essere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di funzionamento Discovery per JDS dalle scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC) del Canada, un NSERC Alexander Graham Bell Canada Borse di studio Laurea (dottorato) (di A. Senatore) e la Heart and Stroke Foundation, Grant -In-Aid NA # 6284.
Materials
| Material | Company | Catalogue Number | Comment |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 – 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Zeiss Canada | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Microelectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , (2003).
- Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
