İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji
Summary
Yüksek verimli için güvenilir bir yöntem<em> In vitro</em> Ifade ve kültürlü insan embriyonik böbrek hücrelerinde rekombinant gerilim-kapılı iyon kanalları (HEK-293T) sonraki elektrofizyolojik kayıt.
Abstract
In vitro ifade ve elektrofizyolojik kayıt kültürlü insan embriyonik böbrek hücrelerinde rekombinant gerilim-kapılı iyon kanalları (HEK-293T), her yerde bir araştırma stratejisi. Komşu hücreler ile temas nedeniyle karıştırıcı etkisi olmadan elektrofizyolojik kayıt için izin vermek için birbirleri ile temas halinde olmayan HEK-293T, böylece hücreleri yeterince düşük yoğunlukta cam lamelleri üzerine kaplama olmalıdır. Transfekte kanalları da gürültü seviyeleri üzerinde saptanabilir akımları tam hücreli yama kelepçe kayıt için plazma membran yüksek verimlilik ile ifade etmelidir. Heterolog iyon kanalları genellikle 28 ° C transfeksiyon sonra yeterli membran ifade elde etmek için uzun inkübasyon süreleri gerektirir, ancak bu sıcaklıkta hücre lamel yapışma ve membran stabilitesi kayıpları artmaktadır. Bu sorunu aşmak için, biz transfect ve plaka HEK-293T hücreleri için optimize edilmiş bir strateji geliştirdi. Bu yöntem hücrelerin nispeten yüksek confluency 28 transfekte ve inkübe olması gerekir ° C yeterli iyon kanalı protein ekspresyonu için izin değişen kuluçka dönemleri post-transfeksiyon. Transfekte hücreler daha sonra cam lamelleri üzerine kaplama ve 37 ° C lamelleri ve membran restabilization sert hücre eki için izin veren birkaç saat inkübe edilir. Hücreler, kısa bir süre kaplama sonra, ya da daha fazla inkübasyon için 28 ° C transfer edilebilir. Biz ilk inkübasyon 28 ° C, transfeksiyon sonra ancak kaplama önce, plazma zarı normalde iyi ifade edemez heterolog iyon kanalları etkin bir şekilde ifade etmek için anahtarı olduğunu bulabilirsiniz. Pozitif transfekte, kültürlü hücreler sadece upstream iç ribozom giriş yeri ve bir eGFP kodlama dizisi cDNA rekombinant iyon kanalı içeren bir bicistronic vektör (örneğin pIRES2-EGFP) ifade, ortak ifade eGFP veya eGFP ile tanımlanır. Tüm hücre yama kelepçe kayıt özel ekipman gerektirir, artı cilalı kayıt elektrotlar ve L şeklindeki zemin elektrotlar borosilikat cam işçiliği. Iyon kanallarının farmakoloji çalışmasında, ilaç dağıtım, doğrudan kayıt çanak içine ilaçlar micropipetting veya microperfusion kaydedilen hücreleri üzerinde kesintisiz akışı ilaç çözüm üretmeye ağırlık akış sistemleri kullanılarak elde edilebilir.
Protocol
Discussion
Açıklanan protokolleri ve çözümleri kullanarak tam hücreli akımları kaydetmek mümkün transfeksiyon başarılı oldu ve istenen gerilim-kapılı iyon kanalları ya da iyon kanal kompleksleri hücre zarının önemli miktarda mevcut olduğunu gösterir. Hücreleri olumlu transfekte (yani floresan yeşil) ama kaydedilebilir akımları, ek süre 28 ° C düzgün bir şekilde paketlenmiş ve hücre zarının içine eklenecek kanal protein için izin istenebilir yok edilmelidir. Uzun süreli inkübasyon 28 ° …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Doğa Bilimleri ve JDS Discovery İşletim Grant tarafından desteklenen Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada, NSERC Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu (doktora) (A SENATORE) ve Kalp ve İnme Vakfı, Hibe # 6284 NA-In-Aid.
Materials
| Material | Company | Catalogue Number | Comment |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 – 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Zeiss Canada | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Microelectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , (2003).
- Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
