在这里,我们描述了一个小鼠肺血管内皮细胞的分离和培养协议。这种方法包括机械和酶的肺组织分解以及2步纯化过程中使用抗PECAM – 1和抗ICAM – 2的抗体结合磁珠,这将产生一个纯粹的原籍大多微血管的内皮细胞的人口。
内皮细胞在血管生物学的许多领域提供了有益的研究模型。自第一次隔离1,人脐静脉内皮细胞(内皮细胞)要方便,容易获得和文化,因此是研究最广泛的内皮细胞。然而,对于重点研究的血管生成,透气性好或许多其他的进程上,微血管内皮细胞(ECS)是一个更有关生理模型 ,研究2。此外,内皮细胞基因敲除小鼠分离蛋白质功能的体外分析提供了一个有用的工具。几种方法来隔离和文化微血管内皮细胞对不同产地已上报日期3-7,但一致的纯内皮细胞的分离和文化仍然是一个在许多实验室的主要技术问题。在这里,我们提供一个可靠和相对简单的方法分离和培养小鼠肺血管内皮细胞(MLECs)一步一步的协议。在这种方法中,肺组织6 – 8岁的幼崽首次切成片,与胶原酶/ dispase(C / D)解决方案,消化和分散成单细胞悬液机械一天。 MLECS纯化细胞悬液,使用抗PECAM – 1抗体结合使用磁粉集中器(MPC)的磁珠阳性选择。这种纯化的细胞培养明胶涂层的组织培养(TC)菜,直到他们成为融合。在这一点上,细胞进一步纯化,再加上以抗ICAM – 2抗体的磁珠。本议定书获得MLECs展示一个鹅卵石的表型,相衬光学显微镜观察,并已被证实使用反VE – cadherin的8和抗VEGFR2的抗体和VE – cadherin的免疫荧光染色流式细胞仪分析其内皮细胞表型。在我们手中,这两个步骤的分离过程中稳定,可靠的收益率的MLECs纯粹的人口,这可以进一步培养。这种方法使研究人员利用基因敲除和转基因小鼠体内研究直接相关,在对孤立MLECs 进行的体外实验结果越来越多的优势, 从而有助于揭示体内观察到的血管表型的分子机制。
微血管内皮细胞已被证明是一个有用的模型在血管生物学的许多领域,被认为是有关生理研究比 3脐静脉内皮细胞广泛的研究(如血管) 。此前,有报道,微血管内皮细胞可以从肾脏,心脏,皮肤,视网膜,脑,神经胶质瘤,脂肪组织和肺2,4-7,10,11获得。然而,微血管内皮细胞的隔离的一致和可靠的方法仍然是必需的。这里介绍的程序是以前发布的协议2的修改;从最公布的程序,它使用了幼崽,而不是成年动物的不同。这是隔离成功的关键,年轻动物的细胞有较高的增殖潜能和来自其组织的文化,往往会产生较高的细胞数量。一个星期的动物似乎是最佳的,但年轻的老鼠(4日龄)也可以使用。此外,可以使用较高或较低的幼崽,如果需要的话,因为我们已经成功隔离MLECs从一个小狗。然而,同时缩放向上或向下的隔离过程中,细胞电镀密度必须保持不变,因为这也是细胞增殖的关键。首先使用共轭磁珠抗PECAM – 1和抗ICAM – 2的抗体比MLECs 2步纯化过程,是更有效的获得纯EC比前面描述的单步纯化过程文化。此协议消除了需要使用很费力的手工技术,梯度离心法和分类丢弃污染的细胞,如成纤维细胞,血细胞和平滑肌细胞的效率较低,流式细胞仪。 MLEC人口所产生的可用于在体外培养的血管生成响应,血管通透性和白细胞轮回分析,伤口愈合以及信号转导通路的生化分析。如果需要,MLECs可镀上不同的表面,如免疫或跨内皮电阻(TER)测量电极阵列的纤维连接蛋白或明胶包被的盖玻片。可以直接得到的结果相比, 在体内 ,这一点特别重要,在越来越多的基因敲除和转基因小鼠线背景下观察到的表型。成功地实施这种方法,在体外体内观察到的缺陷的细胞机制的分析,已提出12。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由美国心脏协会授予0950118G.to MC – W支持部分。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | ||
forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | ||
14G cannula | Fisher | 1482516N | ||
20 ml syringe | BD | 309661 | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | ||
anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | ||
Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | ||
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Pharmingen | 553369 | ||
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Pharmingen | 553326 | ||
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Applied Science | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C | |
DMEM | Cellgro Mediatech | 10-013-CV | ||
Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | ||
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | ||
0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-052-CI | ||
Cell strainer 70 μm nylon | Falcon | 352350 | ||
tissue culture flask 75 cm2 | TPP | 90076 |