In vivo e in vitro de Estudos Adaptor-clathrin Interação
Summary
Clatrina-endocitose mediada depende de proteínas adaptadoras que coordenam a seleção de carga e montagem casaco de clatrina. Aqui nós descrevemos os procedimentos para estudar adaptador clathrin interação física e imagens de células vivas abordagens utilizando como modelo a levedura Sla1p proteína endocítica adaptador.
Abstract
A principal via endocítica inicia com a formação de vesículas revestidas por clatrina (CCVS) que transportam cargas da superfície da célula para endossomos 1-6. CCVS distinguem-se por uma estrutura poliédrica de clatrina que reveste a vesícula de membrana e serve como um andaime mecânico. Clatrina casacos são montados durante a formação das vesículas de indivíduo triskelia clathrin, a forma solúvel de clatrina composto por três subunidades de pesos leves e três de cadeia 7,8. Porque o triskelion não tem a capacidade de se ligar à membrana diretamente, clathrin adaptadores de ligação são críticos para ligar a malha formando clatrina para a membrana através da associação com lipídios e / ou proteínas da membrana 9. Adaptadores também pacote de carga proteína transmembrana, como receptores, e podem interagir entre si e com outros componentes da formação CCV máquinas 9.
Mais de vinte adaptadores clathrin têm sido descritos, diversos estão envolvidos na endocitose mediada clathrin localizar e outros para o Golgi trans rede ou endossomos 9. Com a exceção de HIP1R (levedura Sla2p), todos os adaptadores conhecidos clathrin ligar para o domínio N-terminal da hélice da cadeia clathrin pesados 9. Adaptadores são proteínas clatrina modular composta de domínios cruzados conectados por não estruturados linkers flexível. Dentro destas regiões linker, curto motivos de ligação mediar interações com o domínio N-terminal clatrina ou outros componentes da formação de vesículas máquinas 9. Dois distintos clatrina-binding motivos foram definidos: a caixa de clatrina e do W-box 9. O consenso seqüência clatrina-box foi inicialmente definido como L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, mas variantes foram descobertas posteriormente 11. O W-box está em conformidade com o PWxxW seqüência (onde x é qualquer resíduo).
Sla1p (Lethal sintético com ligação às proteínas actina-1) foi originalmente identificado como uma proteína de actina associados e é necessário para a estrutura normal de actina do citoesqueleto e dinâmicas em locais endocítica em células de levedura 12. Sla1p também se liga o sinal de triagem NPFxD endocítica e é fundamental para endocitose de carga que transportavam o sinal NPFxD 13,14. Mais recentemente, foi demonstrado Sla1p para ligar clatrina através de um motivo semelhante à caixa de clatrina, LLDLQ, denominado uma variante caixa-clatrina (VCB), e funcionar como um adaptador endocítica clathrin 15. Além disso, Sla1p tornou-se um marcador muito utilizado para o revestimento endocítica em células vivas estudos de microscopia de fluorescência 16. Aqui usamos Sla1p como um modelo para descrever abordagens para estudos adaptador clathrin interação. Nós nos concentramos em microscopia de fluorescência de células vivas, GST-pull down, e co-imunoprecipitação métodos.
Protocol
Discussion
Vesículas revestidas por clatrina (CCV) participar de endocitose e transporte do trans Golgi rede e endossomos, vias conservadas que são fundamentais para a biologia célula eucariótica. As abordagens descritas neste trabalho métodos são úteis para estudar os mecanismos moleculares responsáveis pela formação CCV, em especial as interações entre proteínas e adaptador de clatrina. GST-fusion afinidade proteínas e co-imunoprecipitação ensaios permitir o teste de associação física entre um a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DF é apoiado por uma Bridges NSF à comunhão Doutorado. O microscópio utilizado neste trabalho é apoiado em parte pela Microscope Imaging Network infra-estrutura básica bolsa da Colorado State University. Trabalho em adaptadores de clatrina no laboratório do autor é apoiado pela CSU start-up de fundos e de atribuição da American Heart Association 09SDG2280525 para SD
Materials
| Material | Company |
|---|---|
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
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