In vivo en in vitro studies van Adapter-clathrine Interactie
Summary
Clathrine-gemedieerde endocytose afhankelijk van de adapter eiwitten die lading selectie en clathrine vacht montage coördineren. Hier beschrijven we de procedures voor adapter-clathrine fysieke interactie en live cell imaging methoden gebruikt als een model de gist endocytische adapter eiwit Sla1p bestuderen.
Abstract
Een belangrijke endocytische route start met de vorming van clathrine-gecoate blaasjes (CCV), dat het vervoer lading uit de cel oppervlak naar 1-6 endosomen. CCV onderscheiden zich door een polyhedrale rooster van clathrine die jassen de blaasje membraan en fungeert als een mechanische steiger. Clathrine jassen worden geassembleerd tijdens de vesicles van individuele clathrine triskelia, de oplosbare vorm van clathrine bestaat uit drie zware en drie lichte keten subeenheden 7,8. Omdat de triskelion niet de mogelijkheid om direct te binden aan het membraan, clathrine-bindend adapters zijn van cruciaal belang voor de vorming clathrine rooster link naar het membraan door associatie met lipiden en / of membraaneiwitten 9. Adapters Ook pakket transmembraan eiwit lading, zoals receptoren, en kunnen communiceren met elkaar en met andere componenten van het CCV formatie machines 9.
Meer dan twintig clathrine adapters zijn beschreven, een aantal betrokken zijn bij clathrine gemedieerde endocytose en anderen lokaliseren op de trans Golgi netwerk of endosomen 9. Met uitzondering van HIP1R (gist Sla2p), alle bekende clathrine adapters binden aan de N-terminal-propeller domein van de zware keten clathrine 9. Clathrine adapters zijn modulair eiwitten die bestaan uit gevouwen domeinen met elkaar verbonden door ongestructureerde flexibele linkers. Binnen deze linker regio's, korte bindingsmotieven bemiddelen interacties met de clathrine N-terminale domein of andere onderdelen van de vesicles machines 9. Twee verschillende clathrine-bindende motieven zijn gedefinieerd: de clathrine-box en de W-box 9. De consensus clathrine-box sequentie werd oorspronkelijk gedefinieerd als L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, maar varianten zijn vervolgens ontdekt 11. De W-box voldoet aan de volgorde PWxxW (waarbij x is een residu).
Sla1p (Synthetic Lethal met actine bindend eiwit-1) werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een actine geassocieerd eiwit en is nodig voor een normale actine cytoskelet structuur en dynamiek op endocytische sites in gistcellen 12. Sla1p bindt ook de NPFxD endocytische sorteer-signaal en is van cruciaal belang voor de endocytose van de lading met het NPFxD signaal 13,14. Meer recent, Sla1p werd aangetoond dat clathrine te binden door middel van een motief lijkt op de clathrine box, LLDLQ, aangeduid als een variant clathrine-box (VCB), en om te functioneren als een endocytische clathrine adapter 15. Daarnaast is Sla1p uitgegroeid tot een veel gebruikte marker voor de endocytische vacht in levende cellen fluorescentie microscopie studies 16. Hier gebruiken we Sla1p als een model om benaderingen voor adapter-clathrine interactiestudies te beschrijven. Wij richten ons op levende cellen fluorescentie microscopie, GST pull-down, en co-immunoprecipitatie methoden.
Protocol
Discussion
Clathrine-gecoate blaasjes (CCV) deelnemen aan endocytose en vervoer van het trans Golgi netwerk en endosomen, geconserveerd paden die fundamenteel zijn voor eukaryote cel biologie. De benaderingen beschreven in dit document methoden zijn nuttig om de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het CCV vorming, in het bijzonder interacties tussen eiwitten en adapter clathrine te bestuderen. GST-fusie-eiwit affiniteit en co-immunoprecipitatie assays laten testen voor de fysieke relatie tussen een adap…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DF wordt ondersteund door een NSF Bruggen naar het College voor Promoties gemeenschap. De microscoop gebruikt in dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de microscoop Imaging Network kerninfrastructuur subsidie van Colorado State University. Werk aan clathrine adapters in het laboratorium van de auteur en wordt ondersteund door CSU start-up fondsen en American Heart Association Award 09SDG2280525 naar SD
Materials
| Material | Company |
|---|---|
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
References
- Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
- Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Bonifacino, J. S., Traub, L. M. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).
- Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding. Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Kirchhausen, T. Clathrin. Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).
- Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).
- Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. Adaptors for clathrin coats: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).
- Dell’Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin. Science. 280, 431-434 (1998).
- Dell’Angelica, E. C. Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network!. Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).
- Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).
- Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis. J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).
- Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i., Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif. EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).
- Pietro, S. M. D. i., Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain. EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123, 305-320 (2005).
- Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-9561 (1998).
- Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, 1065-1075 (1997).
- Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases. Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 122, 19-27 (1989).
- Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor. Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).
