لإعداد متفرقة الشبكية إلى سجل الاستجابة الخفيفة وراثيا من إعتبر خلايا الشبكية العقدة
Summary
هذا المقال يقدم وصفا لكيفية تشريح وسجل من إعداد الشبكية معزولة في الماوس. على وجه الخصوص ، ونحن تصف كيفية تسجيل الاستجابات الضوء من السكان خلية عقدية fluorescently المسمى لاحقا ، وتحديد وتحليل مورفولوجيا والخمسين.
Abstract
الخطوات الأولى في الرؤية الفقارية تأخذ مكان عند الضوء يحفز المستقبلات الضوئية قضيب ومخروط في شبكية العين 1. ثم يتم فصل هذه المعلومات في ما يعرف المسارات وإيقاف تشغيله. المعلومات مبصرات إشارة الضوء على الخلايا القطبين (BCS) ، والذي يزيل الاستقطاب استجابة للزيادات (في BCS) أو النقصان (إيقاف BCS) في شدة الضوء. هو الحفاظ على هذا الفصل من المعلومات الضوء على مستوى الخلايا الشبكية العقدة (RGCs) ، والتي التشعبات تقسيمها في sublamina إما الخروج من طبقة ضفيري الداخلية (IPL) ، حيث يتلقون مدخلات استثارية مباشرة من BCS معطلة ، أو تقسيمها في في يوم من sublamina IPL ، حيث يتلقون مدخلات استثارية مباشرة من على BCS. هذا الفصل هو الحفاظ على معلومات بشأن الزيادة أو النقصان في الإضاءة (وعلى الممرات وخارج) ، وأشار إلى الدماغ بشكل متواز.
وRGCs هي الخلايا الناتج من شبكية العين ، وبالتالي فهي خلية هامة لدراسة من أجل فهم الكيفية التي اشارت المعلومات الضوء على نواة البصرية في الدماغ. وقد أدت التطورات في مجال علم الوراثة الماوس على مدى العقود الأخيرة في مجموعة متنوعة من خطوط الماوس مراسل فلوري حيث وصفت السكان RGC محددة مع بروتين فلوري للسماح لتحديد الأنواع الفرعية RGC 2 3 4 ومحددة تستهدف لتسجيل الكهربية. هنا ، فإننا نقدم وسيلة لتسجيل ردود الضوء من خلايا العقدة fluorescently المسمى في إعداد سليمة ، الشبكية معزولة. هذا التحضير معزولة الشبكية يسمح للتسجيلات RGCs من حيث جذع شجيري سليمة والحفاظ على المدخلات عبر جذع شجيري RGC بأكمله. هذا الأسلوب هو المعمول عبر مجموعة متنوعة من أنماط فرعية خلية العقدة ، وهي قابلة للطائفة واسعة من التقنيات وحيدة الخلية الفيزيولوجي.
Protocol
Discussion
هذه التقنية قابلة للتطبيق على أي تسجيلات العقدة خلايا شبكية من شبكية العين معزولة. وإن كان في خط الماوس المستخدمة أعلاه حساس في جوهرها ، معربا عن melanopsin – RGCs وصفت مع EGFP 2 ، 5 ، هذا البروتوكول غير قابل للنقل بسهولة إلى خطوط أخرى RGC fluorescently المسمى أو يمكن تعميمها على س?…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة R01EY012949 ، R21EY018885 ، T32 EY0707133. نشكر داروين هانغ على مساعدته التقنية.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ames’ Medium | Sigma | A1420 | ||
| Collagenase | Whorthington Biochemical | LS005273 | ||
| Hyaluronidase | Whorthington Biochemical | LS002592 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | ||
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | ||
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | ||
| Electrodes | Sutter Instruments | BF120-69-10 | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | ||
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | ||
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
- Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).
- Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development. J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).
- Huberman, A. D. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62, 327-334 (2009).
- Siegert, S. Genetic address book for retinal cell types. Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29, 476-482 (2009).
- Newman, E. A., Bartosch, R. An eyecup preparation for the rat and mouse. J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. 신경과학. 160, 126-139 (2009).
- Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision. J Neurosci. 27, 692-699 (2007).
- Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination. J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).
- Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina. Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).
