Summary

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

Published: January 26, 2011
doi:

Summary

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Abstract

Os primeiros passos na visão dos vertebrados ocorrem quando a luz estimula a bastonetes e cones da retina 1. Essas informações são então segregados em que são conhecidas como as vias de ON e OFF. A informação do sinal fotorreceptores de luz para as células bipolares (BCs), que despolarizar em resposta ao aumento (On ​​BCs) ou diminui (Off BCs) na intensidade da luz. Essa segregação da informação luz é mantido no nível das células ganglionares da retina (RGCs), que têm dendritos estratificação em qualquer sublamina o Off da camada plexiforme interna (IPL), onde recebem entrada excitatória direta de Off BCs, ou estratificação em o sublamina On do IPL, onde recebem entrada excitatória direta de On BCs. Essa segregação de informações sobre aumentos ou diminuições de iluminação (a On e Off caminhos) é conservada e sinalizada para o cérebro em paralelo.

O RGCs são as células de saída da retina, e são, portanto, uma célula importante para o estudo, a fim de entender como a informação de luz é um sinal para os núcleos visuais no cérebro. Avanços da genética do rato nas últimas décadas resultaram em uma variedade de linhas repórter fluorescente mouse onde populações específicas RGC são rotulados com uma proteína fluorescente para permitir a identificação de subtipos RGC 2 3 4 e específicas destinadas para gravação eletrofisiológico. Aqui, apresentamos um método para a gravação respostas luz de células ganglionares fluorescente etiquetado em um intacto, isolado de retina. Esta preparação isolada da retina permite gravações de RGCs onde o arbor dendríticas está intacta e as entradas em todo o arbor dendríticas toda RGC são preservadas. Este método é aplicável em uma variedade de subtipos de células ganglionares e é passível de uma grande variedade de uma única célula técnicas fisiológicas.

Protocol

Declaração de Uso de Animais: Os animais foram tratados de acordo com orientações descritas no Manual sobre Cuidados e Uso de Animais de Laboratório, usando protocolos aprovados pela Universidade de Minnesota Animal Care Institucional e Comitê de uso. 1) Preparação das soluções Antes de realizar a gravação eletrofisiológico, soluções intracelular, extracelular e enzimas precisam estar preparados. Solução extracelular: uma garraf…

Discussion

Esta técnica é aplicável a qualquer gravações ganglionares da retina de células a partir de uma retina isolada. Embora na linha do rato usado acima intrinsecamente fotossensíveis, melanopsina expressando RGCs são rotulados com EGFP 2, 5, este protocolo é facilmente transferível para outros fluorescente etiquetado linhas RGC ou pode ser generalizada para gravar a partir de RGCs selecionados aleatoriamente também. Esta técnica é particularmente valioso porque o arbor dendríticas de cada RGC e seus…

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado em parte por concessões do NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Agradecemos a Darwin Pendure a assistência técnica.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Ames’ Medium   Sigma A1420  
Collagenase   Whorthington Biochemical LS005273  
Hyaluronidase   Whorthington Biochemical LS002592  
Sodium Bicarbonate   Sigma S5761  
AlexaFluor 594 Hydrazyde   Invitrogen A10442  
Neurobiotin   Vector Laboratories SP1120  
Electrodes   Sutter Instruments BF120-69-10  
Forceps   Fine Science Tools 11252-30  
Ophthalmologic Scissor   Fine Science Tools 15000-00  
Streptavidin 594   Invitrogen S32356  
Vectashield   Vector Laboratories H-1000  
Goat Serum   Jackson ImmunoResearch 005-000-001  
Triton X-100   Sigma T8787  
Paraformaldehyde   Electron Microscopy Sciences 19210  

References

  1. Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).
  2. Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development. J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).
  3. Huberman, A. D. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62, 327-334 (2009).
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Cite This Article
Schmidt, T. M., Kofuji, P. An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (47), e2367, doi:10.3791/2367 (2011).

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