רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B
Summary
מערכת יעילה של מבנה וניתוח פונקציה של גן ב<em> לשעבר vivo</em> התרבות של לימפוציטים-B הטחול מתואר. שיטה זו מנצלת את ייצור רקומביננטי retroviral ב חופשית עוזר, קו אריזה ecotrophic התא. יציבה, תורשתי הביטוי של הגן של עניין בתוך לימפוציטים העיקרית היא להשיג מוביל לדור של נוגדנים על פני תאים B עוברת לעבור רקומבינציה בכיתה.
Abstract
הביטוי מהונדס של גנים בתאים אוקריוטים היא גישה חזקה גנטית הפוכה שבה הגן של עניין מתבטא בשליטה של מערכת ביטוי Heterologous כדי להקל על ניתוח של פנוטיפ שהתקבל. גישה זו ניתן להשתמש כדי לבטא את הגן כי לא נמצא בדרך כלל האורגניזם, להביע את טופס מוטציה של מוצר הגן, או יתר להביע בצורה דומיננטית שלילית של המוצר גן. זה שימושי במיוחד במחקר של מערכת hematopoetic, שבה תקנה תעתיק הוא מנגנון בקרה מרכזי בהתפתחות והתמיינות של תאים B 1, הנסקרת ב 2-4.
עכבר הגנטיקה הוא כלי רב עוצמה ללימוד גנים מחלות אנושיות. ניתוח השוואתי של העכבר הגנום האנושי מגלה שימור synteny של מעל 90% של הגנום 5. כמו כן, רוב הטכנולוגיה שבה נעשה שימוש במודלים של העכבר הוא ישים בחקר הגנים האנושיים, למשל, שיבושים גנים החלפת allelic 6 . עם זאת, יצירה של עכבר מהונדס דורש מידה רבה של משאבי הטבע הן כספי וטכני. מספר פרויקטים כבר החלו לאסוף ספריות של לדפוק את זני העכבר (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) או mutagenesis זנים המושרה (RIKEN), אשר דורשים בקנה מידה גדול מאמצים ושיתוף פעולה 7. לכן, רצוי קודם ללמוד את הפנוטיפ של הגן הרצוי במודל התא התרבות של תאים ראשוניים לפני שממשיך במודל של עכברים.
ה-DNA retroviral משתלב ה-DNA המארח, רצוי בתוך או ליד יחידות שעתוק או איים CPG, והתוצאה היא יציבה תורשתי הביטוי של הגן ארוז עניין תוך הימנעות השתקה תעתיק 8 9. הגנים מתועתקים אז בשליטת מקדם יעילות גבוהה retroviral, וכתוצאה מכך יעילות גבוהה של שעתוק וייצור חלבונים. לכן, הביטוי retroviral ניתן להשתמש בתאים שקשה transfect, ובלבד התאים נמצאים במצב פעיל במהלך מיטוזה. מכיוון גנים מבניים של הנגיף נמצאים בתוך הקו תא אריזה, וקטורים ביטוי בשימוש לשבט את הגן של עניין אינם מכילים גנים מבניים של הנגיף, אשר שניהם מבטלת את האפשרות של revertants ויראלי מגביר את בטיחות של עבודה עם supernatants ויראלי כמו virions לא זיהומיות מיוצרים 10.
כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור רקומביננטי retroviral זיהום הבאות של תאים B הטחול. לאחר הבידוד, התאים בתרבית הם הטחול מגורה עם lymphokines נגזר ה 'אנטי CD40, אשר מעוררת פרץ של התפשטות תאים B ו בידול 11. פרוטוקול זה הוא אידיאלי ללימוד אירועים המתרחשים מאוחר בהתפתחות התא B ו בידול, כמו תאים B מבודדים הטחול בעקבות האירועים hematopoetic הראשונית אבל לפני גירוי antigenic להשרות התמיינות plasmacytic.
Protocol
Discussion
התמרה retroviral של תאים B הטחול כפי שתואר כאן, כמתואר באיור 1 היא גישה גנטית שימושי במחקר של לימפוציטים-B כי רבים מן האירועים התפתחותיים lymphopoesis נשלטים על ידי תקנה תעתיק 1, 2. בשלבים מאוחרים יותר של ההתבגרות תא B, מפעילה באמצעות CD40L חיוני לזירוז הצמיחה תא B, הכניס…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CK נתמכת על ידי תוכנית קולומביה בוגרת אוניברסיטת. UB הוא בחור של לוקמיה לימפומה וחברה של אמריקה, זכה בפרס החוקר חדש מהקרן לחקר לוקמיה והוא נתמך על ידי הפקולטה באוניברסיטת קולומביה בניו הזנק וקרנות.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
References
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. . Introduction to Genetic Analysis. , (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
