여기 우리는 여성의 검은 과부 거미의 복부에서 비단 생산 땀샘을 제거하는 효율적인 전략을 설명합니다. 이 절차는 일곱 별개의 비단 생산이 높은 정화 패션, 거미 실크의 생산 및 섬유 조립을 공부 조사를위한 중요한 프로세스의 분비를의 급속한 고립 수 있습니다.
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방법 논문
블랙 위도우 스파이더 실크 생산 땀샘의 Microdissection
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
현대 스파이더는 운동, 먹이 캡쳐 및 자손 1,2을 개발의 보호를 포함하여 생물 학적 기능의 광범위한 높은 성능의 실크 섬유를 스핀. 거미는 다양한 기계적 특성을 가지고 몇 가지 서로 다른 파이버 유형을 회전하여 이러한 작업을 수행. 섬유 종류의 이러한 전문 작은 biofactories 같은 기능을 다른 비단 생산 분비의 진화를 통해 발생했습니다. 이러한 biofactories 제조 및 섬유 생산을위한 실크 단백질의 대량를 저장합니다. 생화 학적 사건의 복잡한 일련의를 통해 다음과 실크 단백질은 압출시 고체 물질로 액체에서 변환됩니다.
기계 연구 거미 비단 높은 인장 강철 3보다 더 강한 것을 증명하고있다. 거미 실크 스레드의 구조와 기능 사이의 관계를 이해하는 분석 거미 실크는 크게 자신의 단백질 시퀀스 4 이내 블록 반복을 가지고 단백질, 또는 fibroins들로 이루어져 것으로 나타났다있다. 놀라운 인장 강도와 거미 실크 옷의 확장성에 기여하는 일반적인 분자 서명 번역 실크 cDNAs의 분석을 통해 풀어되고 있습니다. 거미 실크 옷의 특별한 재료 속성을 감안할 때, 전세계 연구소 이해하고, 상업 군사 및 산업용 애플 리케이션을위한 합성 실크 섬유를 생산하기 위해 회전 과정을 모방하기 위해 경주하고 있습니다. 연구 실험실에서 인공 거미 실크를 회전하는 주요 과제 중 하나는 실크 생산 땀샘에서 섬유의 압출하는 동안 발생하는 생화학 과정의 전체 이해를 포함한다.
여기서 우리는 7 개의 비단 생산의 주요 및 사소한 ampullate의 땀샘을 포함 cobweaving 검은 과부 거미에서 분비를 5,6, tubuliform [합성 달걀 케이스 실크] [드래그 라인 및 발판 실크를 제조] 7 격리하는 방법을 제시 , 8, flagelliform [코브 - 위버스에서 알 수없는 함수], 집계 [글루 실크하게], aciniform [합성의 먹이 포장 계란 케이스 스레드] 9 pyriform 10 [첨부 디스크 실크를 생산]. 이 접근법은 이산화탄소 가스, 복부에서 cephalothorax의 후속 분리 및 비단 생산 분비를 얻기 위해 복부의 microdissection와 거미 anesthetizing을 기반으로합니다. 다른 비단 생산 분비의 분리에 따라,이 조직은 식별 정량적 실시간 PCR, 북부 및 서부 모래 바닥, 질량 분석계 (MS 또는 MS / MS)는 분석을 포함하여 별개의 생화 학적 분석에 대해 다른 macromolecules를 검색하는 데 사용할 수 있습니다 새로운 실크 단백질 시퀀스, 실크 조립 경로에 참여하거나, 세포 배양 또는 histological 실험에 대한 손상 조직을 사용하는 단백질을 검색합니다.
프로토콜
1. 복부의 스파이더와 절연을 Anesthetizing
- 플라스틱 (그림 1A)이 줄지어 판지 상자에 유리 항아리에서 거미를 전송합니다. 우리는 일반적으로 woodpiles, 차고 또는 덤불에서 거미를 수집하고 유리 단지에있는 실험실에서 그들을 집. 거미가 플라스틱 안감을 올라가 수 없기 때문에, 그것은 anesthetizing 목적을 위해 작은 유리병에 유리 병 또는 커피하실 수 있습니다 거미를 전송하는 효율적인 방법을 제공합니다. 이 시점에서 거미를 처리하는 동안, 당신은 안전을 위해 라텍스 장갑이나 원예 장갑 두 쌍을 착용해야합니다.
- 거미 플라스틱 줄지어 상자에있는 동안 그 후면에서 거미에 접근하고 플라스틱 문화 약병에 거미 슬라이드를 보자. 거미가 병을를 입력 후, 즉시 상단 (그림 1B)를 통해 플러그인을 놓으십시오. 우리는 약 101.6 mm X 31.75 mm (L X D)입니다 병을 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 anesthetizing 단계에 필요한 이산화탄소 가스의 양을 최소화합니다.
- 10 분 (그림 1C)에 평방 인치당 5~10파운드에서 이산화탄소 가스를 도입하여 거미를 마취. 가스의이 금액은 너무 anesthetization 후 즉시 1.4-1.5 단계를 진행해야합니다, 5 분 주위에 거미를 노크합니다. ....
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토론
검은 과부 거미의 실크 생산 땀샘의 microdissection을위한 우리의 방법론은 높은 정화 비단 생산 분비를 얻을 수있는 효과적인 수단을 제공합니다. 해부는 일곱 별개의 전체 집합 비단 생산 cobweavers의 분비를 항복, 1.5-3 시간에 완료할 수 있습니다. 높은 정화 실크 글랜드 샘플을 구하기 조사관에게 다른 선들에 선택적으로 표현 유전자에 대한 mRNA 수준의 질량 분광법, 분석을 사용하여 선의 luminal 내용에 저장되어있는 새로운 실크 또는 보호자의 단백질의 식별을 포함하여 생화학 연구의 넓은 범위를 수행할 수있는 능력을 수 그리고 실크 생산의 메커니즘을 연구하기 위해 체외에서 특정 분비의 culturing.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 블랙 위도우 스파이더 실크스의 NSF 루이 부여 MCB - 0950372받을 분자 특성에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 염화나트륨 | Electron Microscopy Sciences | SX0420-1 | 물에 0.1 M |
| 디에틸 파이로카보네이트 | Sigma-Aldrich | D-5758 - 5 ml | 0.1% v/v |
| 시트르산나트륨 | Sigma-Aldrich | S1804 - 1 kg | 물에 0.015 M |
| 해부 현미경 | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| 디지털 현미경 카메라 | Leica Microsystems | DFC320 | 소프트웨어 - Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas 가위 | World Precision Instruments, Inc. | 500260 | |
| 스테인리스 스틸 핀셋 | World Precision Instruments, Inc. | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| 곤충 핀 | Indigo Instruments | 33414-2 | 곤충 핀 #2 |
| 소형 또는 대형 해부 접시 | Living Systems Instrumentation | DD-50-S 또는 DD-90-S | 직경 52 mm x 높이 18 mm (Sylgard 깊이 ~6mm) 또는 93 mm x 22 mm |
| Drosophila 배양 바이알 | Carolina Biological | FR-17-3076 | 크기는 직경 31.75 mm x 101.6 mm |
참고문헌
- Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys....
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