प्रोटोकॉल Confocal लेज़र स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) के लिए माइक्रोबियल biofilms बढ़ रही है और विश्लेषण के लिए एक प्रवाह सेल प्रणाली के आवेदन का वर्णन.
कई माइक्रोबियल कोशिकाओं बिना डंठल माइक्रोबियल biofilms कि गुण शारीरिक और रोग मुक्त रहने वाले सूक्ष्मजीवों की तुलना में बदल दिया है के रूप में परिभाषित समुदायों फार्म करने की क्षमता है. प्रकृति में Biofilms अक्सर जांच करने के लिए और खराब परिभाषित 1 शर्तों के अधीन रहते हैं मुश्किल है. एक पारदर्शी बुनियाद का उपयोग करना यह संभव है कि डिवाइस के लिए एक प्रणाली है जहां सरल biofilms वास्तविक समय में एक गैर विनाशकारी रास्ता में जांच की जा सकती है: यहाँ हम इन विट्रो 3 डी अध्ययन में माइक्रोबियल biofilms के लिए विधानसभा और एक प्रवाह सेल मॉडल प्रणाली के आपरेशन प्रदर्शन अच्छी तरह से परिभाषित 2,3 शर्तों के तहत उच्च reproducibility सृजन.
कि biofilm के लिए विकास चैम्बर के रूप में कार्य करता है एक प्रवाह सेल प्रणाली के होते हैं. प्रवाह सेल और एक मध्यम कुप्पी से पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के साथ एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से आपूर्ति की है और खर्च मध्यम बर्बादी कंटेनर में एकत्र किया जाता है. प्रवाह प्रणाली के इस पुराने प्रवाह चैम्बर में विकसित कोशिकाओं के कम से कम अशांति के साथ पोषक तत्वों जैसे एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन की एक सतत आपूर्ति की अनुमति देता है. इसके अलावा, प्रवाह कक्ष के भीतर प्रवाह की स्थिति के अध्ययन biofilm कतरनी तनाव को उजागर अनुमति देते हैं. एक बुलबुला टयूबिंग है जो अन्यथा प्रवाह कक्ष में biofilm संरचना को बाधित कर सकता से डिवाइस सीमीत हवा बुलबुले फँसाने.
प्रवाह सेल प्रणाली Confocal लेज़र स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) के साथ संगत है और जिससे माइक्रोबियल biofilms के विकास के बारे में 3 डी अत्यधिक विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते हैं. Biofilm में कक्ष फ्लोरोसेंट जांच या CLSM विश्लेषण के साथ संगत प्रोटीन के साथ लेबल किया जा सकता है. यह ऑनलाइन दृश्य सक्षम बनाता है और विकासशील biofilm में niches के जांच की अनुमति देता है. माइक्रोबियल आपसी संबंध, antimicrobial एजेंटों या विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की जांच, कई प्रयोगात्मक setups कि प्रवाह सेल प्रणाली में जांच की जा सकता हैं.
हम एक प्रवाह सेल प्रणाली है कि biofilm जांच में एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है प्रदर्शन किया है. Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी इमेजिंग के साथ संयुक्त, प्रणाली और अधिक परंपरागत सूक्ष्म तकनीकों के माध्यम से माइक्रोबियल biofilms विश्लेषण के अन्य तरीकों की तुलना में लाभ की एक सीमा है. इस प्रणाली समुदाय की गड़बड़ी के बिना माइक्रोबियल biofilm समुदायों रहने के 3D दृश्य की अनुमति देता है. लाइट माइक्रोस्कोपी biofilm के niches के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान नहीं करता है और जबकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी biofilm के nanoscale संकल्प प्रदान करता है, यह जीना सेल इमेजिंग की अनुमति नहीं है.
वर्णित प्रवाह चैनल सिस्टम हम पहले बैक्टीरियल कोशिकाओं कई 08/05 (चित्रा 4a) एंटीबायोटिक दवाओं के लिए संवेदनशील, कोशिकी यौगिकों के वितरण के स्थानिक वितरण elucidated है का उपयोग करना, जैसे 9-11 डीएनए और गतिशील और गैर चलता – फिरता कोशिकाओं के वितरण एक जीवाणु समुदाय 4,6,9 (चित्रा 4c) के भीतर एक ही प्रजाति है. हम कल्पना है कि प्रवाह सेल प्रणाली खमीर biofilms के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह खमीर biofilm विकास में शामिल जीन की पहचान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, fungicides जैसे पर्यावरणीय कारकों के जवाब में spatio खमीर biofilm के अस्थायी वितरण किया जा सकता है. हालांकि खमीर गतिशील और गैर चलता – फिरता कोशिकाओं में अंतर करने के लिए नहीं जाना जाता है, biofilm विविधीकरण के अन्य पहलुओं में रूपात्मक बदलाव और खमीर से pseudohyphal कोशिकाओं के लिए अगुणित से द्विगुणित कोशिकाओं को बदलाव के रूप में इस तरह के अध्ययन हो सकता है.
हम एक प्रणाली है कि कई माइक्रोबियल प्रजातियों के साथ अनुपालन और कई धुंधला तकनीक के साथ काम करेंगे पता चला है. अलग धुंधला जांच और GFP जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, की एक किस्म, विकासशील biofilm में विशिष्ट आला जांच सक्षम और antimicrobial एजेंटों या अन्य पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव का विश्लेषण करने में एक कुशल उपकरण है. जानकारी प्राप्त किया जा सकता है कि बहुत विस्तृत है (चित्रा 4) और biofilm में सुविधाओं को 12,13 COMSTAT के रूप में कंप्यूटर प्रोग्राम के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है.
कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण पहलू यह है कि यह एक समय लेने वाली प्रक्रिया है. यह भी एक सीमा है कि कोशिकाओं को एक गैर फ्लोरोसेंट, पारदर्शी सतह पर विकसित करने में सक्षम होने की जरूरत है. प्रणाली उच्च throughput प्रदर्शन के लिए एक अनुभवी शोधकर्ता के रूप में उपयुक्त नहीं है, के बाद से biofilm गठन एक confocal खुर्दबीन, गहराई है कि कुछ सौ 14 माइक्रोमीटर तक सीमित है जांच किया जा सकता है का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया है और आगे तकनीकी डिजाइन में निहित सीमाएँ हैं ज्यादातर प्रयोग, के बारे में 15 चैनलों के प्रति जो बारी में कई दिनों लेने के लिए तैयार कर सकते हैं पर संभाल कर सकते हैं. हालांकि, एंटीबायोटिक दवाओं या म्यूटेंट कि biofilm के अध्ययन के लिए प्रासंगिक माना जाता है शुरू क्रिस्टल बैंगनी धुंधला के रूप में अन्य विधियों के साथ जांच से पहले सबसे दिलचस्प उम्मीदवारों प्रवाह सेल प्रणाली को हस्तांतरित कर रहे हैं बड़े पैमाने पर किया जा सकता है. कांच कवर शीट बहुत पतली है और आसानी से तोड़, और देखभाल जब सिस्टम हैंडलिंग लिया जाना चाहिए. टयूबिंग, इसके अलावा एक प्रयोग के चलाने के दौरान दैनिक जांच करना चाहिए, के रूप में काफी बस नदी के ऊपर प्रवाह कोशिकाओं के इनलेट ट्यूब में "वापस विकास" हो सकता है. इस तरह संदूषण सिलिकॉन ट्यूब के प्रवाह कोशिकाओं के इनलेट की ओर से कई सेंटीमीटर हटाने के द्वारा हल किया जा सकता है, बाँझ तकनीक का उपयोग.
चित्रा 4 4) दिन पुराने PAO1 – GFP Colistin और Propidium आयोडाइड के साथ 24 के लिए मृत (धुंधला लाल दाग) ख) एक तीन दिन के 3 डी प्रस्तुति पुराने पी. के लिए इलाज biofilm. PAO1 aeruginosa (पी. aeruginosa जंगली प्रकार) – GFP biofilm 6 ग) 3 डी एक PAO1 की तस्वीर प्रस्तुति – CFP Pila उत्परिवर्ती (नीला) के साथ एक PAO1 जंगली प्रकार YFP (पीला) घ) 5 दिन पुराने PAO1 – GFP biofilm एक 3 डी के रूप में प्रस्तुत चित्र) ई 26 घंटे एस. cerevisiae biofilm (CEN.PK पृष्ठभूमि में PTR3 उत्परिवर्ती) 15 Syto – 9 के साथ दाग .
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |