Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

Summary

여기 형광와 결합 microinjection의 전원을 고용 분석을 설명 현장에서 하이브 리다이 제이션.

Abstract

eukaryotes에서 메신저 RNA (mRNA)가 핵에 베꼈는데되고 번역 기계에 액세스하는 세포질에 수출해야합니다. mRNA의 핵 수출이 Xenopus oocytes의 ^1과 같은 효모 ² Drosophila S2 파생된 셀 ^{3 호선으로} 취급하기 쉬운 유전자 생물에서 널리 연구되어 있지만, 몇 가지 연구는 포유 동물 세포에서 실시했다. 또한 포유 동물 체세포의 mRNA 수출의 반응 속도론은 간접적으로 ^4,5 유추 수 있습니다. 포유 동물 조직 배양 세포에서 mRNA의 핵 수출 속도론을 평가하기 위해, 우리는 현장의 하이브리드화 (물고기)의 형광와 결합 microinjection의 전원을 고용 분석을 개발했습니다. 이러한 assays는 포유 동물 세포에 mRNAs의 대부분이 splicing에 의존하게 ^6,7으로 수출, 또는 신호 순서 코딩 영역 (SSCR) ^6과 같은 특정 RNA의 시퀀스를 필요로하게됩니다 입증하는 데 사용되었습니다. 이 분석에서는, 세포는 mRNA 합성 또는 관심있는 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA와 중 체외에서 microinjected 있습니다. microinjected 세포 그런 다음 고정 및 RNA의 하위 세포 로컬 리 제이션이 물고기를 사용하여 평가됩니다 여러 시간 지점 incubated 수 있습니다. 전사는 핵산의 추가 후 몇 시간이 발생 transfection에 대조적으로, DNA 또는 mRNA의 microinjection은 빠르게 표현 가능하며 정확한 운동 데이터의 생성을 허용합니다.

Protocol

에 체외 합성 mRNA, 또는 mRNA로 생체내에 베꼈는데있다 플라스미드 DNA의 주입, 포유 동물 세포에서 mRNA 수출의 속도론을 측정하는 데 사용할 수있는 두 microinjection 기반의 방법이 있습니다. 각 기술은 장점과 단점이 있습니다. 여기 우리 둘 다 기술을 설명하고 두 방법의 차이점에 대해 설명합니다.

1. 사출을위한 자료 준비

1. 체외 베꼈는데 mRNA에서
   1. mRNA는 plasmids하거나 적절한 RNA 효소 프로 모터 (예 : T7 또는 SP6 발기인)에 의해 상류의 어귀까지 관심의 유전자를 포함하는 PCR 제품 중 하나에서 베꼈는데 있습니다. 녹음은 관내 적절한 세포핵과 초과 캡 아날로그와 적절한 효소 (T7 또는 SP6 RNA 효소, Invitrogen)을 사용하여 수행됩니다.
   2. 성적표는 제조 업체의 프로토콜에 따라 폴리 - A - 중합 효소 (Invitrogen)와 ATP를 사용하여 체외에서 polyadenylated 있습니다.
   3. mRNA 다음 Invitrogen 또는 Qiagen 중의 열을 이용하여 정화됩니다.
   4. Eluted mRNA 그 다음 30 분 4에서 1만3천g에서 원심 분리 ° C 다음에 한 시간 만이라도 1/20th 볼륨 3M의 칼륨 아세테이트 및 -20 ° C에서 100 % 에탄올 2 볼륨을 추가하여 시켰던 있습니다. 과잉 액체가 존재하는 경우, 펠렛은 얼음 차가운 70 % 에탄올로 씻어 수 있습니다.
   5. 그 결과 mRNA 펠렛은 공기가 주입 후 버퍼 (140mM KCl과 10mM HEPES의, 산도 7.4)에 solubilised 건조됩니다. 어떤 오염 물질 에탄올은 microinjected 세포에 독성이있을 수 있습니다. solubilized mRNA는 -80 ° C에서 장기 보관을위한 보관하실 수 있습니다.
   6. microinjection 들어, mRNA는 사출 버퍼에 200μg/ml로 희석하고 오레곤 그린 488 (OG) - 복합 70kDa dextran (1mg/ml, Invitrogen)와 혼합. OG - 복합 dextran은 핵 구멍에 걸쳐 확산이 너무 커서 때문에, 한뿐 아니라 주입 세포를 식별할뿐만 아니라, 얼마나 많은 액체가 핵에 주입하고 얼마나 많은 세포질로 유출되었다 결정하는 데 도움이 (가능하게 ) 4.1.2을 참조하십시오. 또는 핵 구멍을 통과 수없는 모든 형광등, 높은 분자량 분자가 사용할 수 있습니다.
   7. 샘플은 잠재적으로 바늘 끝을 방해 있습니다 펠렛 모든 미립 물질하기 위해 바늘을 로딩하기 전에 적어도 20 분 4 ° C에서 13,000g에서 centrifuged 있습니다.
2. 플라스미드 DNA
   1. 관심있는 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA는 Qiagen에서 표준 DNA 정제 키트를 사용하여 준비하실 수 있습니다. 일반적으로 큰 DNA 준비는 높은 품질 경향이 있으므로보다 효율적으로 주사 후 베꼈는데 있습니다.
   2. 플라스미드 DNA는 OG - 복합 70 KDA dextran (1mg/ml)를 포함하는 주입 버퍼에 200μg/ml 50를 희석합니다.
   3. 전에 바늘을 로딩하기 위해 분사 유체은 최소한 20 분 4 ° C에서 1만3천그램에서 centrifuged입니다.
3. microinjection을 위해 바늘
   1. 2.5mm 필라멘트와 셔터 p97 플라밍 / 브라운 Micropipette 풀러를 사용, 바늘은 1.0mm borosilicate 유리 모세관 튜브 (세계 정밀 주식 회사 인스 트루먼 트의 항목 # 1B100F - 3)에서 가공하고 있습니다.
   2. 주사 바늘은 2.5x4.5 mm 상자 필라멘트 (항목 # FB245B, 셔터 악기 (주))를 사용하여 3 단계 끄는 프로그램을 사용하여 생성됩니다. 본 실험에 사용되는 프로그램 매개 변수가 다음과 같습니다, 그러나 그들은 각각의 필라멘트에 최적화된해야합니다.

      # 단계	열	당기세요	속도	시간	압박
      1	740	100	8	250	500
      2	740	100	8	250	500
      3	740	100	10	250	500

      
      (램프의 온도 = 740)
4. 셀 준비
   1. 일반적으로 모든 포유 동물 세포주를 microinjected 수 있지만 잘 보급되어 세포 유형 주사에 더 순종하는 경향이 있습니다. 세포주의 선택은 다른 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 분비 단백질에 대한 코드가 endoplasmic reticulum의 표면에 타겟이 훨씬 더 눈에 띄는 COS - 7 세포에있다 mRNAs은 NIH 3T3 섬유아 세포에 비해 ⁶ (그림 3 T - ftz - Δi의 mRNA의 현지화 비교 4).
   2. 전지는 microinjection에 적어도 24 시간 이전에 대한 30mm petridishes의 산성 - 세탁 평방 coverslips (25x25mm)에 씨앗을해야합니다. 특정 세포 라인에서 확산은 fibronectin 코팅 coverslips ^6,8에 도금 세포 자극 수 있습니다. 이상적으로 세포 monolayer는 사출시 약 70-90% 합류한다.
   3. 주입된 세포가 쉽게 식별 가능하도록하려면 셀 monolayer은 200μl 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 이전에 주입하는 부상이다. 일반적으로 교차 상처 (그림 1)은 coverslip에 새겨져 있으며, 세포는 이전에 조직 문화 인큐베이터에 주사로 적어도 15 분에 대한 복구 남아 있습니다.
   4. microinjection 동안, 조직 문화 미디어 서서히 확산에 CO _2를 잃고 결과는 알칼리되면서. 주입하는 동안 중립 산도를 유지하기 위해, 미디어 10mM HEPES pH를 7.4로 보충 수 있습니다. 추가 버퍼 미디어 microinjection 전날에 추가할 수 있습니다.
5. 현미경과 Micromanipulator
   1. 세포는 microinjection 프로세스에 혼란을 일으키는 수있는 진동을 최소화하기 위해 공기 테이블에 격리되어 거꾸로 현미경을 사용하여 microinjected 있습니다. 현미경은 두 개의 목표를 갖춘, 세포와 바늘을 위치로 사용되는 건조 10X 조각, 및 이미지 microinjection 프로세스를하는 데 사용되는 건조 40x 추가 긴 작동 거리 위상 목표.
   2. 목표가 수정 목걸이를 가지고있는 경우 coverslip 및 petridish 전체보기 세포에 의한 광학 aberrations은 멸망하게 될 수 있습니다. 현미경의 브라이트가 제대로 쾰러 조명, ⁹ 정렬 있도록, 또한 사출 바늘 (2.2.4 참조)에 의해 분산되는 빛의로 인한 aberrations에 대한 정확한 도움이 될 것입니다.
   3. 바늘은 3 축 조이스틱 걸려 미세 조작 장치 (NT - 88 - V3MSH, Narishige)에 의해 제어됩니다. 거친 조작하는 사람은 원래 위치를 유지하면서 바늘이 쉽게 그릇​​에 제기하고 낮아 수 있도록하기 위해 현미경의 뒷면 기둥을 확보합니다.
   4. 바늘은 거친 조작하는 사람에 고정되어있는 지팡이로 보안이됩니다. microinjection 니들의 일각에서 액체를 추출하는 데 필요한 사출 압력을 생성, 튜브 5cc 유리 주사기 (백톤 디킨슨 항목 # 512311)에 지팡이를 연결합니다. 압력 수준을 제어하려면, 주사기 바렐과 피스톤은 두 개의 stoppers, 파이프 클램프 (모든 하드웨어 매장에서 사용 가능) 두 금속 클램프 (그림 2)로 구성되어 주사기 조절기에 의해 위치에 개최됩니다. 주사기가 높은 압력, 진공 그리스 (다우 코닝)를 유지하도록하려면 것은 주사기의 플런저에 적용됩니다.
6. 형광등 하이브리드화 프로브
   1. 주입 핵산의 기본 시퀀스는 같은 RNAstructure 4.6 ¹⁰ RNA 이차 구조 예측 소프트웨어를 사용하여 접혀 있습니다.
   2. mRNA 폴드는 시각과 같은 긴 이중 가닥으로 높은 용융 온도와 이차 구조를 무료로 경향이 약 50 세포핵의 영역을 식별하는 평가입니다.
   3. 이 지역의 반대로 보완이 프로브의 5 '끝에 첨부 Alexa546 형광단로 합성된다 (이러한 통합 DNA 기술에서 구입하실 수 있습니다.)
   4. 프로브가 100μM의 농도로 물로 희석합니다 후 2-3 년 동안 -80 ° C에 저장됩니다.

2. Intranuclear Microinjection

1. microinjection 현미경에 분사 유체를 로딩
   1. 분사 유체의 약 1μl는 사용 centrifuged DNA 또는 mRNA 샘플에서 가져온 것입니다GELoader 팁 (항목 # 022351656; Epindorff). 액체가 바늘을 방해할 수 있습니다 미립 물질이 들어있는 펠렛을 방해하지 않도록 샘플 상단에서 aspirated해야합니다.
   2. 피펫의 팁을는 바늘의 백 엔드에 삽입되고 액체가 나옵니다. 액체는 모세관 현상에 의해 바늘 끝에 그려되고 끝 가까이에 초승달 모양 5 - 30sec 이내에 표시되어야합니다.
   3. 유체 채워진 주사 바늘 다음 45 ° 각도에서 micromanipulator에 고정되어있는 지팡이로 삽입됩니다.
   4. 바늘은 10X 목적으로 시각이고 거친 micromanipulator 단자를 사용하여 초점 비행기 근처 보는 비행기의 중앙에 위치합니다. 바늘은 나중 단계 (2.2.2)에 손상되는 다음 현미경의 뒷면 기둥이 반격에 나섰고입니다 않도록하기 위해 몇 mm를 증가합니다.
   5. 압력은 플런저 0.5 - 2cc을 누르 증가합니다.
2. Microinjection
   1. 부상 monolayer와 커버 슬립을 포함 petridish가 보는 단계에 있습니다.
   2. 현미경 뒤 기둥을 정렬하는 콘덴서와 바늘이 액체를 입력 원인, 직립 위치로 앞으로 가져온 것입니다. 이것은 (2.1.4 참조) coverslip에 깨는에서 바늘을 방지하기 위해 신중하게 이루어져야합니다.
   3. 10X 목표를 사용하여 십자가 상처의 중심이 식별되고 주사 바늘을 주입하는 세포 위에 위치합니다.
   4. 확대는 40x 목표로 전환하고 바늘이 조이스틱의 미세 조정 손잡이를 사용하여 저하와 중심 증가합니다. 이미지가 초점이있다면, 하나는 (1.5.2 참조) 버트랜드 렌즈를 사용 (예 : Kölher 조명 ⁹⁾ 입사 광이 제대로 정렬되어 있는지 확인해야합니다.
   5. 주사는 상처 크로스 중 한 모퉁이에 시작하고 시각화하는 동안 주입된 세포 (그림 1 참조)을 쉽게 식별 한 가장자리 계속해야합니다.
   6. 바늘은 핵 접촉하도록 저하됩니다. 하나는 쉽게 휴대가 주사를 함께 위상 밝기의 주목할만한 변화로 주입되었음을 알 수 있습니다.
   7. 유체가 전체 세포를 가득 채워지면 그것은 압력이 너무 높게하고 낮아한다는 것을 나타낼 수 있습니다.
   8. 단계의 밝기에 변화가 감지되지 않으면,이 중 microinjection 압력이 피어스 세포막 정도로 확실하지 않다고 또는 바늘 끝이 막힌 것을 나타낼 수 있습니다. 부족한 압력, 주사 바늘에 결함, 작은 미립 물질로 바늘 끝의 차단이 다음을 포함한 여러 문제의 결과 수 있습니다. micromanipulator에 각각의 바늘을 로딩 때문에 시간이 소요되며, 사출 기판은 종종 매우 가치 있기 때문에, 그것은 효과적으로 주사에 사용할 수있는 바늘의 비율을 최대화하는 것이 중요합니다. 아래 단계에 의해 막힌 바늘 팁 차단을 해제하려고 단계 안내. 각 단계 후, 하나는 장애물이 제거되었는지 여부를 평가하는 2 3cells를 삽입하려고합니다

      	동작	목적 및 목표
      1	바늘 끝의 길이를 볼 수 초점을 조정합니다.	바늘이나 칼끝을 차단 미립자의 큰 조각이 있는지 분명 불완전가 있는지 확인하려면 다음과 같이하십시오.
      2	접시에 미립자를 떠다니는 뚜껑의 한 조각 옆에있는 바늘 끝을 놓으십시오.	유체의 팁을 종료있다면 그것은 바늘과 직접 접촉으로 오는없이 입자를 선동한다.
      3	주사기의 끝까지 플런저를 우울하게	압력이 임시 증가 끝에 어떤 방해 선택을 취소해야합니다. 플런저을 발표 후, 자체 어코드 상승해야한다 그렇지 않으면 이것이 의미하는 압력은 주사기에 지어진 접속되지 않는 당신은 연결 및 / 강화 또는 추가 진공 그리스를 추가해야합니다.
      4	세포 의학의 바늘을 올려IA	수성 매체 밖으로 바늘을 그리기의 힘이 바늘의 끝에 장애물을 이동시키다 수 있습니다.
      5	완전히 주사기의 플런저를 제거하고 다시 삽입.	압력이 추가 증가는 바늘의 끝부분을 취소 할 수 있습니다.
      6	coverslip의 깨끗한 부분에 바늘 팁을 스크래치	이것은 더 이상은 바늘 내의 미립자를 요동치과 끝에 방해를 완화하기 위해 그것을 조정하는 데 도움이됩니다. 강한 긁힘은 바늘을 종료 방해를 지원, 팁의 끝 부분에서 칩 수 있습니다.
      7	새로운 바늘로드

      
      
      또 다른 일반적인 문제는 더욱 주사기의 플런저를 우울하여 자주 보상을 요구, 바늘 내의 압력의 점진적 상실입니다. 종종, 주사기의 플런저 추가 진공 그리스를 추가하면보다 일관된 압력을 유지할 수 있습니다. 그러나이 문제가 누출 주사기와 튜브, 튜브 및 지팡이 또는 지팡이와 바늘 사이의 연결로 인해 수 있습니다. 지팡이와 바늘 사이에 누출이 오직 지팡이에 고무 가스켓을 변경하여 해결할 수 있지만 대부분의 공기 누출은 Parafilm (피셔) 또는 필요한 경우 기름을 사용하여 봉인 수 있습니다.
   9. 상처 가장자리 세포는 시간이 일정 기간 (10 - 15)에 대한 상처 가장자리 microinjected 있습니다. 연습 수백 세포이 간격 동안 주입 수 있습니다.
   10. microinjection 후, 전지가 37 incubated 아르 ° 이전 고정 시간이 원하는 금액에 대한 조직 문화의 인큐베이터에서 C. 성장 미디어 용해, DNA를 주입하면, 전사는 α - amanitin (시그마 - 알드리치 1μg/ml)와 세포를 치료하여 20 분 후에 종료됩니다. 이 농도는 효과적으로 (그림 3) microinjected 플라스미드의 전사를 억제.
   11. 바늘이 microinjected 것을 때 하나의 DNA 또는 RNA 변경의 종류를 교체해야하지만, 하나의 주사 바늘을 여러 coverslips를 삽입하는 활용할 수 있습니다. 일단 바늘이 지팡이에서 제거 처리가 불가능한 물품은 폐기하고 재사용하지해야합니다.
   12. 데드 또는 떠다니는 세포가 종종 바늘 끝에 충실하고 microinjection을 방해할 수 있습니다. , 바늘에서이 잔해를 제거 기둥을 밀어 내야하여 액체의 바늘을 제기하고 천천히 수직 위치로 기둥을 readjusting하여 액체에 바늘을 돌려 다시 삽입합니다.
   13. mRNA 핵 수출 동력학 측정의 정확한 측정을 얻으려면 별도의 샘플은 0min에 고정되어야 15 분, 30 분, 60 분 및 120min 후 RNA의 microinjection, 또는 α - amanitin 치료 후.

3. 세포 고정과 스테 이닝

1. 세포 고정과 Permeabilization
   1. 적절한시기에, 성장 미디어는 aspirated되고 전지 2 ML PBS 용액 (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM 나 ₂ HPO _4, 2mM KH ₂ PO _4, pH를 7.4)로 두 번 씻어 있습니다. 그들이 액체에 빠져들하지 않는 시간을 최소화하여 촉촉한 coverslips을 유지하는 것이 중요합니다.
   2. 전지는 상온에서 적어도 15를 위해 PBS에 4 % paraformaldehyde (전자 현미경 과학)의 2ml를 추가하여 해결됩니다.
   3. 고정 샘플은 PBS 솔루션으로 두 번 씻어 있습니다.
   4. 세포는 2ml 0.1 %의와 permeabilized 아르 트리톤 상온에서 적어도 15 분 동안 PBS에서 X - 100.
   5. 샘플은 PBS 솔루션으로 두 번 씻어 있습니다.
2. 생선 스테 이닝
   1. 다음 샘플 하이브 리다이 제이션에 대비해야합니다. 세포는 1X SSC 용액 (150mM NaCl, 15mM 나트륨 구연 산염, 산도 7.0) 25~60%의 formimide와 함께 두 번 씻은 있습니다. 포름 아미드의 금액 (3.2.3 참조) 하이브 리다이 제이션 솔루션에있는 것과 같은 농도를 사용합니다.
   2. 얼룩 챔버를 준비하려면, 150mm petridish의 바닥은 물로 덮여 있으며 Parafilm의 조각이 물 위에 떠오르입니다. 물이 Parafilm은 접시의 바닥을 준수 수 있도록함으로써, 접시를 통해 회전에 의해 제거됩니다. 기포가 수동으로 다시 아르옮겼습니다.
   3. 각 coverslip에 대한 하이브 리다이 제이션 솔루션의 스테인드, 100μl 방울 (25~60%의 포름 아미드, 100mg/ml dextran 황산염, 1mg/ml E. 대장균 tRNA, 탐사선이 1:500 희석와 1X SSC에 5mM vanadyl riboside 복합) pipetted 아르 수 parafilm에. 포름 아미드의 양을 사용되는 특정 생선 프로브에 최적화된되어야합니다.
   4. 포셉의 도움으로, coverslip 그 다음 고정을 건조하지 않고 정면 측면에서 사악한 왓먼 여과지 (VWR) coverslip의 백 사이드 (셀 - 무료 사이드) 건조 및 과도한 버퍼가 있습니다 사용, 30mm petridish에서 제거됩니다 세포. coverslip은 다음 생선 솔루션에 얼굴을 아래로 배치됩니다. 이것은 각 coverslip에 대해 반복됩니다.
   5. 다시 얼룩 챔버 뚜껑을 배치 후, 샘플은 37 ° C.에 5 - 18hrs에 대한 incubated 아르
3. 스테인드 샘플을 세척 및 장착
   1. 여러 세척 챔버는 얼룩 챔버와 같은 방식으로 (3.2.2 참조)에 만들어집니다.
   2. 각 coverslip 들어, 세척 버퍼 (25-60%의 포름 아미드와 1X SCC) 1 ML은 세척 챔버의 parafilm에 pipetted입니다. 다시 말하지만, (3.2.3 참조) 하이브 리다이 제이션 솔루션에 존재하는 포름 아미드 같은 농도를 사용합니다.
   3. 세척 버퍼의 1ml 얼룩 챔버에서 coverslips를 제거하려면 coverslip 옆에 pipetted입니다. 액체는 모세관 작용에 의해 각각의 샘플을 아래에 그려져 있어야합니다.
   4. 포셉를 사용하여 coverslips이 제거되고 각각 씻어 버퍼의 드롭에 위치하고 있으며 5 분 실온에서 incubated.
   5. 3.3.2을 3.3.4 단계는 각 coverslip가 3 회 총 씻어되도록 두 번 더 반복합니다.
   6. RNA는 immunofluorescence에 의해 약간의 단백질과 costained있다면, 섹션 3.4을 참조하십시오.
   7. 슬라이드는 70 % 에탄올로 씻은하고, Kimwipes로 건조됩니다. 각 coverslip 들어, DAPI (Fluoromount G, 서던 생명 공학)와 솔루션을 장착의 10-30 μl은 슬라이드에 pipetted입니다. 각 슬라이드는 두 coverslips을 수용할 수 있습니다.
   8. 포셉 및 왓먼 필터 용지를 사용 coverslips 뒷면은 건조하고 초과 액체는 샘플을 건조하지 않고 coverslip의 전면 측면에서 사악한입니다. 각 coverslip 그런 다음 설치 솔루션의 드롭에, 얼굴 아래로 배치됩니다.
   9. 탑재된 샘플 4 저장할 수 있습니다 ° C.
4. Immunofluorescence 스테 이닝
   1. 샘플은 적절한 항체 얼룩을 방해할 수있는 포름 아미드를 제거하는 PBS로 두 번 세탁해야합니다.
   2. 기본 항체 용액 (1.0μg/ml 항체, 0.1 % TX - 100, PBS의 0.1mg/ml RNAse 무료 BSA)의 각 50μl coverslip에 대한 세척 챔버 parafilm에 pipetted입니다.
   3. 포셉를 사용 coverslips은 기본 항체 용액에 세포 측면을 배치하고 30 분에 대해 실온에서 부화 사용할 수 있습니다.
   4. 각 coverslip 들어, PBS의 두 1ml 방울 세척 챔버의 parafilm에 pipetted 있습니다.
   5. 항체 얼룩 솔루션에서 coverslips을 제거하려면, PBS의 1ml는 coverslip 옆에 pipetted입니다. 액체는 모세관 작용에 의해 각각의 샘플을 아래에 그려져 있어야합니다.
   6. 포셉를 사용하여 coverslips이 제거되고 각 위치에 대한 5 분 PBS의 첫 번째 드롭에 그리고 다른 5 분을위한 PBS의 두 번째 드롭에 위치.
   7. 단계 3.4.2을 3.4.6은 형광 차 항체 솔루션 (1.0μg/ml 항체, 0.1 % TX - 100, 0.1mg/ml BSA의 PBS)를 사용하여 반복됩니다. 사출 마커와 RNA는 녹색과 적색 채널에서 볼 수 있기 때문에, 보조 항체 이러한 Alexa647로 호환 염색에 복합 있어야합니다.
   8. Coverslips는 3.3.7에서와 같이 탑재합니다.

4. 이미징 및 부량

1. 이미징
   1. epifluorescence 현미경이 이미지를 주입 다음 세포를하는 데 사용됩니다. 주입 세포는 십자가 상처를 찾기 및 주입 마커 (OG - dextran)으로 세포를 식별하여 찾을 수 있습니다.
   2. 각각의 세포가 관찰 들어, 주입 OG - dextran의 사진이 취득됩니다. 이미지가 mRNA를 microinjected 언제 부량이 핵에 주입 유체 (즉, dextran)의> 90 %를받은 세포로 제한하는 것이 중요합니다.
   3. RNA의 이미지가 취득됩니다. RNA의 정확한 측정을 할 수 있도록, 주어진 시간 코스 내의 모든 셀 사이의 노출 시간은 카메라의 동적 범위 내에서 지속적인 가을 유지됩니다. 이상 적으로는 각 이미지는 적절한 배경 형광 inte을 계산할 수 있도록 uninjected 세포를 포함해야nsity (4.2.4 참조).
   4. 부량에 투입, 얼룩 DAPI의 이미지도 취득하실 수 있습니다. immunofluorescence이 수행될 경우 또한, 스테인드 단백질도 몇 군데 있습니다. 시간 코스의 여러 지점에서 mRNA 분포의 예제는 그림 4에 표시됩니다. mRNA는 분비 단백질을 암호화하기 때문에 COS - 7 세포에 응급실에 타겟팅됩니다. ER - 타겟팅이 TRAPα, 주민 ER 단백질에 대한 항체로 ¹¹ RNA를 공동 염색법에 의해 검증되었다합니다.
2. 부량
   
   이것은 다른 이미지 분석 소프트웨어 패키지의 번호를 수행할 수 있습니다. ImageJ 소프트웨어가 수동으로 핵 및 세포질 분수를 구분하는 데 사용할 수 있기 때문에 세포 mRNA 분포를 quantifying에 적합, 그것이 분수의 평균 형광을 측정할 수 있으며, 그 출력 데이터를 쉽게 같은, 복사 및 기타 소프트웨어에 붙여넣을 수 있습니다 Microsoft Excel에서.
   1. 생선, OG - dextran과 DAPI 형광에 해당하는 이미지가 열고 도구를 스택에 이미지를 사용하여 병합됩니다.
   2. DAPI 또는 dextran 계층 중 하나의 임계값 도구는 microinjected 핵에 해당하는 영역을 분리하는 데 사용됩니다. 이 분수는 원드 도구를 사용하여 선택되어, 그리고 물고기 계층, 지역 _(Nuc)와 (F _Nuc) 강도 평균 / 의미로 이동 후 측정 도구를 사용하여 기록됩니다.
   3. 셀 경계는 자유형 선택 도구를 사용하여 설명하고, 물고기 레이어의 영역 _(토크)와 (F _토크) 평균 강도 / 의미는 측정 도구를 사용하여 녹화하는 동안. 휴대폰의 형광이 배경보다 훨씬 강렬한 경우, 당신이 문턱 도구 대신 원하는 세포를 대략적으로 자유형 선택 도구를 사용할 수 있습니다.
   4. 사각형 선택 기능 사용 상자 uninjected 세포와 의미 / 평균 강도 (F _백) 기록을 통해 그려진 것입니다.
   5. 모든 측정은 Excel 워크시트에 복사됩니다.
   6. 수출 mRNA는 다음 방정식을 사용하여 계산됩니다 :
      
      

      Nuc	핵 면적
      토크	전체 셀 면적
      F Nuc	핵 분수의 평균 형광
      F 토크	전체 세포 분획의 평균 형광
      F 백	untransfected 세포의 평균 형광

      
      각 시점의 평균 %의 수출이 계산되고 시간이지나면서 꾸몄다.
   7. 시간이 지남에 따라 - mRNA의 안정성의 평균 총 mRNA의 형광을 (F _{백) 토크} X (F _토크) 계획하고 계산합니다. 일반적으로 우리는 mRNA의 양이 세포 사이 coverslips 사이에 크게 다릅니다 것을 발견했습니다. 이것은 바늘 흐름 속도 사이에 물고기 얼룩의 효율성 사이의 불일치로 인해 수 있습니다.

그림 1. 그들은 다음 200μl 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 수직과 수평으로 부상 70~90%의 합류되기 전까지의 Microinjection coverslip. 세포는 성장하고 있습니다. 십자가 - 상처에서 시작, 세포 하나의 상처 가장자리 (화살표)를 따라 주입하고 있습니다.

그림 2. 주사기 조절기. A) 흐름 다이어그램은 주사기 조절기가 조립하는 방법 시연. 조립 장치의 B) 도식. 조립 주사기 조절기의 C) 사진.

그림 3. 주입 플라스미드 DNA의 전사에 대한 α - amanitin의 효과. 농도 변화와 사전 처리되었습니다 NIH3T3 fibroblast 세포,α - amanitin의 S는 T - ftz - Δi 플라스미드 DNA와 OG - 복합 70kD dextran과 함께 주입했다. 주입 세포는 37 incubated 있었다 ° 1 시간 후 특정 물고기 probe6를 사용하여 T - ftz - Δi의 mRNA에 대한 고정 및 스테인드위한 C. 각 행은 OG - 70kDa dextran과 T - ftz - Δi의 mRNA에 대한 몇 군데보기의 한 분야에 해당합니다. 그 높이지만, 낮은 아니라 참고 약물의 농도가 완전히 T - ftz - Δi의 명시 생산을 저해. 스케일 바 = 15μm.

그림 4. mRNA 핵 수출의 시간 코스. COS - 7 세포는 T - ftz - Δi 플라스미드 DNA와 OG - 복합 70kD dextran과 함께 주입했다. 30 분 다음 사출 세포는 α - amanitin로 치료하고 37 ° C 지정된 시간 지점 incubated되었습니다. 세포 그런 다음 고정 및 T - ftz - Δi의 mRNA 반대하고 응급실 마커에 대한 항체와 TRAPα 프로브 물들일되었습니다. 각 행은 세포의 단일 필드에 해당합니다. microinjection의 timecourse 다음 A) mRNA 분포. B) (A)에서 120min 시점의 최대 폭발은 T - ftz - Δi의 mRNA와 응급실의 공동 지방화를 시연. T - ftz - Δi의 mRNA (녹색) 및 TRAPα (적색) 얼룩의 오버레이는 오른쪽 패널에 표시됩니다. 스케일 바 = 15μm.

Discussion

Microinjection 다른 세포 프로세스의 숫자를 연구하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 기존의 세포 transfection 달리, microinjection은 연구자가 효과적으로 매우 좁은 기간 내에 세포 핵에 핵산을 소개하실 수 있습니다. 그 결과, 하나는 mRNA 수출, mRNA의 현지화 및 단백질 합성의 속도를 결정하는 등 운동 분석을 수행할 수 있습니다. 또한, 실험의 기간은 비교적 짧은이기 때문에, 하나는 pleiotropic 효과를 발생하지 않고 짧은 시간에 걸쳐 내에 독성 화합물로 세포를 노출하실 수 있습니다. 또한, 그러한 지배 부정적인 단백질로 억제 또는 stimulatory 화합물은 핵산과 함께 공동 주입 수 있습니다. 마지막으로, microinjections은 종종 세포에 독성이 서로 다른 세포 기능을 교란 수 있습니다 transfection의 시약에 대한 요구 사항을 피할 수 있습니다.

플라스미드 DNA를 주사 대 mRNA

삽입하는 핵산은 고려의 숫자에 따라 달라집니다 중 선택할 수 있습니다. 플라스미드 DNA를 주사를 따라 RNA 중합 효소 II는 mRNA를 합성뿐만 아니라, 초기 사본 ^12,13에 단백질 요소를 모집뿐만 아니라. 이러한 요소는 이러한 mRNA 처리, 원자력 수출 및 세포질 현지화 같은 이벤트를 제어 때문에, 플라스미드 DNA를 주사는 전사가 하류 프로세스에 결합하는 방법 파악하기 위해 사용될 수 있습니다. 전사가 핵 수출 ¹⁴ 결합 수 있지만, 우리는 주입 mRNA가 약간 빠른 생체내 베꼈는데 mRNA ⁶ 이상의 수출 것으로 나타났습니다. 이에 대한 이유가 지금 분명 아니지만,이 결과로 새로 합성된 mRNA는 RNA 중합 효소 II에서 나온다 것을 제안할 수 있습니다, 그것은 그 저능​​아 핵 수출 단지로 묶여있을 수 있습니다.

mRNA 주사 몇 가지 이점이 있습니다. 첫째, 연구자는 세포가 RNA의 전반적인 신진 대사를 조절하는 방법에 영향을 미칠 수있는, RNA 효소 억제제를 사용할 필요가 없습니다. 둘째, RNA는 사출하기 전에 체외에서 수정할 수 있습니다. 예를 들어, mRNAs 이러한 기능이 핵 수출 ⁶ 미치는 영향 평가하기 위해 다양한 5 '모자 analogues 또는 폴리 (A) 꼬리 길이와 합성 수 있습니다. 셋째, 주입 RNA의 정확한 금액은 대략 예상하실 수 있습니다. 위에서 설명한 프로토콜에 따라, 우리는 전형적인 포유 동물 세포 (400,000에 850,000 분자) ¹⁵ 성적의 총 개수에 비해 약 20,000 50,000 분자가 비교적 작고 각 핵에 주입하는 예상하고있다. mRNA의 주사와 함께 가장 큰 단점은 microinjection 동안 세포질로 주입 유체의 일부 누수가 불가 피한 때문입니다. 세포질에 직접 주입 mRNA가 오랜 기간 (A. 집이되지 않은 관찰)을 통해 안정되기 때문에 별도의주의가 세포를 계량하는 선택로 이동합니다. 일반적으로 우리는 OG - dextran의 분포에 의해 평가 핵에 주입 유체의> 90 %를받은 세포를 분석할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
주입 버퍼	Sigma-Aldrich		140 mM KCl 및 10 mM HEPES, pH 7.4
Oregon Green 488-70kD Dextran	Invitrogen	D7173	주입 버퍼에 10mg/ml의 재고는 -80°에서 장기간 보관할 수 있습니다. C
붕규산 모세관	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
주입 바늘 로딩을위한 젤 로딩 피펫 팁	Eppendorf	022351656
현미경	Nikon Instruments	Eclipse Ti-S
Micromanipulator	Narishige International	NT-88-V3MSH
주사기	BD Biosciences	512311
PBS 버퍼	Sigma-Aldrich		137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4
SSC 버퍼	Sigma-Aldrich		150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4
4% 파라포름알데히드	전자 현미경 과학	15686	37% 파라포름알데히드 스톡은 PBS
0.1% Triton X-100(Surfact-Amps)	에 희석됩니다.써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific, Inc.)	28314	10% Triton X-100 스톡은 PBS
포름아미드	Fisher Scientific	F84-1
덱스트란 설페이트	Fisher Scientific	BP1585-100
E. coli tRNA	Sigma-Aldrich	R1753
Vanadyl riboside complex (VRC)	Sigma-Aldrich	R3380
Whatman 여과지	국제	28298-020
진동 제어 테이블	Kinetic Systems	5702E-3036-21
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-20
α-amanitin	Sigma-Aldrich	A2263
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
진공 그리스	다우코닝	695400008
T7 RNA 중합효소	New England Biolabs	M0251S
폴리(A) 중합효소	Ambion	AM1350
혼성화 완충액	시그마-알드리치		100mg/ml 덱스트란 설페이트, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM 구연산나트륨, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% 포름아미드